高脂通过线粒体通路诱导H9c2心肌细胞损伤

刘 涛，李 晶，鲍翠玉

(湖北科技学院1. 药学院、2. 糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100)

随着人口老年化、城市化进展加快、人们生活条件的改善，糖尿病(diabetes mellitus，DM)呈快速增长和低龄化的趋势，目前全球患病人数已达4.25亿，预计2045年可达6.29亿，我国糖尿病患者人数众多，给家庭和社会带来极大负担[1-2]。糖尿病对全身大、小血管危害较大，50%～80% DM患者死亡的主要原因为心血管并发症[3]。然而，DM是如何引起心血管损伤的，目前尚不清楚。有研究发现，高脂毒性在DM早期就对心肌产生不良影响，并且脂毒性的危害远远高于糖毒性[4]，DM患者将过度摄取的脂肪酸积聚在心脏，引起心肌细胞结构和功能发生改变，导致心肌细胞凋亡，引起脂毒性心肌病[5]。目前，许多学者围绕脂毒性对心肌损伤及其机制进行研究，发现脂代谢调控与线粒体通路调控二者之间存在一定联系[6]。有文献指出[7]，DM患者的高脂血症增加心肌细胞线粒体损伤，并增加细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，最终使心肌细胞出现凋亡，但线粒体凋亡通路是否介导了高脂诱导的心肌细胞损伤，国内外尚未见报道。基于此，本实验通过观察高脂对H9c2心肌细胞增殖、线粒体膜电位、ROS水平、线粒体凋亡信号通路相关蛋白表达的影响，探讨高脂所致H9c2心肌细胞的损伤或凋亡与线粒体通路之间的相关性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系 H9c2大鼠心肌细胞，购于上海通派生物有限公司。

1.1.2试剂 高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清、MTT(美国Gibco公司)；棕榈酸(palmitic acid，PA)，购自美国Sigma公司；DAPI染液(武汉谷歌生物有限公司)；细胞ROS试剂盒、ECL试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；线粒体膜电位试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；Annexin V FITC-PI细胞凋亡试剂盒(南京建成生物工程研究所)；抗Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cleaved casepase-3抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.1.3仪器 超净工作台(苏州安泰公司)；CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)；HVE-50 高压灭菌器(日本Hirayama公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；酶标仪(美国Bio-Tek公司)；自动发光凝胶成像系统(英国SYNGENE公司)；垂直式电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1PA的配制 精密称取PA粉末25.642 mg倒入EP管中，然后加入1 mL无水乙醇，将EP管进行超声震荡至完全溶解后，使用滤膜过滤，制备PA母液浓度为100 mmol·L-1。使用前，37 ℃水浴锅将PA储存液完全溶解至无沉淀物，使用时，将PA按不同浓度与0.5% BSA的DMEM培养基混合。

1.2.2细胞培养 H9c2心肌细胞培养于高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清和双抗)中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养至70%～80%融合时，用含0.25% EDTA胰酶消化细胞，传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3实验分组 ① PA浓度梯度:分为对照组、PA(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)组；②PA时间梯度：分为对照组、PA作用不同时间(12、24、36、48 h)组；③为了评估线粒体凋亡通路在脂毒性心肌损伤中的作用，按PA浓度梯度分组，刺激时间为24 h。

1.3检测指标

1.3.1MTT法检测H9c2心肌细胞增殖率 在相应的板中接种H9c2心肌细胞悬液(细胞2×107～2×108·L-1，每孔100 μL)，每组设置6个复孔。在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜，按照实验设计，加入不同浓度含PA的培养基，继续培养；实验结束后，弃去孔内上清液，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，培养4 h后弃培养液，加入DMSO；在570 nm处检测各孔OD值，按照以下公式计算细胞增殖率，细胞增殖率=实验组OD值/正常对照组OD值×100%。

1.3.2细胞ROS的检测 向24孔板每孔接种500 μL H9c2心肌细胞悬液过夜，不同浓度含PA的高糖DMEM培养基处理细胞，继续培养24 h，弃去孔内培养基，用不含胎牛血清的DMEM清洗2遍，按1 ∶500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制ROS试剂盒试剂，每孔加入500 μL配制好的试剂，细胞培养箱中培养20 min，弃去孔内培养基，用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室温静置10 min，1×PBS清洗2遍后，收集细胞爬片，用抗荧光淬灭封片剂封片。在倒置荧光显微镜20倍镜下观察，拍照。

1.3.3检测细胞凋亡 24孔板每孔接种500 μL H9c2心肌细胞悬液过夜，不同浓度含PA的高糖DMEM培养基处理细胞，继续培养24 h，弃去孔内培养基，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定10 min，用PBS洗涤细胞3次，每次5 min。每孔加入400 μL Annexin V-FITC结合液，再向每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，放入细胞培养箱等待10 min。用PBS洗涤细胞3次，每次5 min，封片后，用共聚焦荧光显微镜检测凋亡细胞。

1.3.4线粒体膜电位的检测 向24孔板每孔接种500 μL H9c2心肌细胞悬液过夜，不同浓度含PA的高糖DMEM培养基处理细胞，继续培养24 h，弃去孔内培养基，用PBS洗涤细胞2次，每次5 min。加入500 μL培养液，再加入500 μL JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min。孵育后，弃上清，用JC-1(1×)洗2次，加入2 mL培养液，用共聚焦荧光显微镜检测膜电位。

1.3.5蛋白免疫印迹检测 实验结束后，用PBS清洗并裂解刮净细胞，收集到离心管中，离心，取上清液，BCA法蛋白定量后。进行SDS-PAGE凝胶电泳，并转膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，线粒体通路相关蛋白及凋亡相关蛋白的一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，用ECL显影液处理，经凝胶成像仪检测Cyt-C、Cleaved casepase-3、Bax、Bcl-2的表达水平。

2 结果

2.1高脂刺激对H9c2心肌细胞增殖率的影响Fig 1A结果显示，与正常对照组相比，不同浓度PA(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)刺激H9c2心肌细胞24 h时，细胞增殖率分别为97.99%、78.41%和57.72%。 与正常组比较，PA 0.2 、0.4 mmol·L-1组细胞增殖率均明显下降(P<0.01)。Fig 1B结果表明，0.2 mmol·L-1PA刺激H9c2心肌细胞0、12、24、36、48 h时，高脂所致的心肌细胞增殖率为94.24%、85.76%、72.24%、50.72%，与正常组相比，呈现浓度依赖性下降趋势。PA 0.2 mmol·L-1刺激心肌细胞36、48 h时，细胞增殖率出现50%以上的下降(P<0.01)，而36 h与48 h组之间差异无显著性(P>0.05)。

2.2高脂刺激对H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响如Fig 2所示，与正常对照组比较，红色荧光随PA的浓度增大而减弱，而绿色荧光增强。在PA为0.4 mmol·L-1时，细胞数目明显减少，形态出现明显不规则现象，红光变弱，而绿光变亮。由于线粒体在膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质内，形成红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质内，产生绿色荧光。结果表明，随着PA的浓度逐渐增加，线粒体膜电位逐渐降低，并且细胞出现凋亡现象。

2.3高脂刺激对H9c2心肌细胞氧化损伤的影响如Fig 3所示，与正常对照组比较，PA浓度为0.2 mmol·L-1时，细胞中ROS水平有所增加，当PA浓度为0.4 mmol·L-1时，细胞数量急剧减少，细胞质与细胞核均发生不同程度的改变，如细胞肿大、细胞核质浓缩、细胞内容物外溢等现象。

A:Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1; B:Cell viability was significantly suppressed when incubated time exceeded 36 h and 48 h in 0.2 mmol·L-1PA.**P<0.01vscontrol (0 mmol·L-1PA).

Fig 2 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte mitochondrial membrane potential(×20)

2.4高脂刺激对H9c2心肌细胞凋亡的影响Fig 4结果表明，与正常对照组相比，PA浓度为0.1 mmol·L-1时AnnexinV-FITC标记的绿色荧光明显增强，PI标记的红色荧光在PA浓度为0.2 mmol·L-1时开始增强，细胞质与细胞核均发生轻微形态学改变。在PA浓度为0.4 mmol·L-1时细胞数目明显减少，出现细胞凋亡相关形态学改变。

2.5高脂刺激对H9c2心肌细胞线粒体凋亡信号通路的影响如Fig 5所示，与正常对照组相比，PA 0.4 mmol·L-1组Cyt-C和Cleaved casepase-3蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，而PA 0.1、0.2 mmol·L-1组与正常对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。在PA刺激24 h的情况下，Bcl-2表达持续降低，PA 0.4 mmol·L-1组Bcl-2表达明显低于正常对照组(P<0.05)，而Bax持续升高，在PA 0.4 mmol·L-1时明显高于正常对照组(P<0.05)。Bcl-2、Bax在PA 0.1、0.2 mmol·L-1时与正常组之间差异无显著性(P>0.05)。

3 讨论

心肌病在临床上分为原发性与继发性，脂毒性心肌病属于继发性心肌病，由于心脏中脂质大量积聚，机体对脂肪酸的摄取和利用远大于心肌细胞实际的氧化代谢需要，使心肌细胞内脂质大量蓄积[8]，而蓄积的脂质又对心肌产生毒性，造成心肌细胞损伤，从而导致心肌细胞脂代谢产物和介质堆积。增加的脂肪酸也可以引起线粒体ROS产生过量，并且不能及时有效地清除，引起细胞氧化应激损伤和ATP生成减少，导致脂毒性心肌损伤[9]。因此，脂肪酸代谢紊乱是引起心肌细胞凋亡和功能障碍的重要原因之一。本研究结果显示，H9c2心肌细胞在持续高脂环境刺激下，细胞存活率随时间和浓度的增加逐渐下降，在PA浓度为0.4 mmol·L-1时，时间为24 h时极为明显。PA 0.2 mmol·L-1时ROS明显增强，细胞形态出现异常，而PA 0.4 mmol·L-1时细胞数量减少，细胞凋亡增加。说明高浓度脂肪酸可使心肌细胞发生氧化应激损伤，导致细胞的形态和数目发生改变，最终导致心肌细胞出现凋亡，影响心脏的正常功能。本研究结果与文献报道一致。

Fig 3 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte oxidative damage(×20)

Fig 4 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte apoptosis(×20)

Fig 5 Influence of palmitic acid concentration on expression of Cyt-C,Cleaved casepase-3,Bax and Bcl-2 in H9c2

*P<0.05vscontrol (0 mmol·L-1PA)

脂肪酸参与心肌病的病理过程相当复杂，心肌细胞脂代谢紊乱，引起细胞器如线粒体、内质网功能异常，线粒体凋亡通路作为细胞凋亡的内源途径，是近年来研究热点之一[10]。线粒体膜通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)在维持线粒体和细胞物质信息交换方面起着重要作用，它通过节律性开放来保持膜内外的离子梯度和电势差，从而调控细胞凋亡。凋亡刺激因素可以使MPTP由周期性开放变为持续性开放，致使线粒体膜电位下降或消失、呼吸链功能破坏、形成细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)大分子通道，激活caspase-9介导的细胞凋亡[11]。此外，刺激因素也可通过降低线粒体的膜电位、改变线粒体膜磷脂等损伤线粒体[12]。本研究显示，高脂刺激H9c2心肌细胞24 h后，与正常组相比，JC-1绿色荧光增强，红色荧光减弱，表明高脂导致线粒体膜电位下降，线粒体膜的完整性破坏，细胞出现早期凋亡，如细胞数目减少，失去正常形态，表现出细胞凋亡相关的形态学改变，而且免疫印迹结果显示线粒体凋亡蛋白Cyt-C、Cleaved caspase-3表达明显增加，进一步说明细胞发生凋亡。因此，高脂刺激H9c2心肌细胞能引起线粒体膜电位下降、相关凋亡蛋白表达升高，从而促进细胞损伤或凋亡。

Bcl-2家族中存在促凋亡因子(Bax)和抗凋亡因子(Bcl-2)，它们具有调控细胞凋亡的作用。Bcl-2大多位于线粒体外膜上，调节线粒体外膜通透性，具有抑制凋亡的作用。当Bcl-2表达下降时，线粒体通透性增加，外膜孔径变大，变大的线粒体孔径导致线粒体中Cyt-C的释放以及凋亡诱导因子增加。Bax是与Bcl-2共沉淀的X蛋白质，Bax/Bcl-2比值增加，细胞出现凋亡[13]。本研究结果显示，H9c2心肌细胞在高脂作用24 h后，Bax在PA 0.4 mmol·L-1时表达明显升高，而Bcl-2降低，表明高脂刺激H9c2心肌细胞通过增加线粒体膜通透性来引起细胞凋亡。

综上所述，高脂刺激H9c2心肌细胞能够抑制细胞增殖，引起H9c2心肌细胞ROS水平的增加，线粒体膜电位的降低，最终诱发线粒体凋亡蛋白的表达。提示线粒体凋亡通路在高脂诱导H9c2心肌细胞损伤中起重要的调控作用，进而为理解脂毒性心肌损伤的形成机制提供了新的线索。然而，线粒体通路调控脂毒性心肌病的病理机制，以及是否还存在其他信号通路调控糖尿病心肌病线粒体凋亡通路，仍需进一步阐明。