免疫佐剂的复合化研究进展①

樊 凡 方 成

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉430023)

近年报道7种新型佐剂被批准用于人用疫苗：病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)、基于角鲨烯乳剂(MF59)、咪喹莫特(Imiquimod)、雷西莫特(Resiquimod)、AS01(AS，Adjuvant system)、AS03和AS04，其中复合佐剂的占比接近一半，复合化已成为佐剂发展的一大趋势[1]。现对复合佐剂的研究现状做一综述。

1 以铝盐为载体的复合佐剂

铝盐佐剂作为世界上首次批准的人用疫苗佐剂，已使用了90年[2]。铝盐具有较大的表面积和较高的电荷密度，可将抗原吸附在表面。虽然铝盐可提高疫苗的抗体滴度，但没有证据表明可增强细胞免疫。而增强细胞免疫应答对多种疾病的防疫十分必要。因此将细胞免疫刺激物吸附在铝盐上是复合佐剂的重要策略。

1.1铝盐+Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)配体[单磷酰脂质A(Monophosphoryl lipid A，MPL)] 2009年美国批准的人类乳头状瘤病毒16/18(Human papillomavirus-16/18，HPV-16/18)疫苗以AS04为佐剂，它是由TLR4配体MPL吸附于氢氧化铝构成。AS04较铝盐可以诱导更高水平的HPV特异性抗体和记忆B细胞[3]。AS04在注射部位短暂激活转录因子NF-κB[4]，诱导IL-2和IFN-γ的产生[1]。在24 h内，AS04直接触发树突状细胞和单核细胞提呈抗原并向淋巴结转移[5]。AS04对抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)快速而短暂的刺激使其能够处理高浓度抗原[6]。AS04也被用于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)疫苗[7]。将TLR4配体脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)加入以铝为基础佐剂的破伤风类毒素疫苗，发现LPS增加了IgG1和IgG2a抗体的产生，同时减少TH2型免疫反应，但TLR4配体MPL降低TH2反应的效果较弱[8]。

1.2铝盐+TLR4配体(CIA05) CIA05是一种来源于LPS突变体的TLR4激动剂，被证明使小鼠脾细胞增强表达抗HBV表面抗原的抗体和IFN-γ[9]。它与铝盐合用可增加血清中抗炭疽保护性抗原抗体和毒素中和抗体的滴度[10]。CIA05和铝盐按1∶50的比例组成的复合佐剂称为CIA06，以其为佐剂的HPV疫苗诱导的抗原特异性IgG抗体滴度、脾IFN-γ的分泌和记忆B细胞在免疫后24周仍然保持高水平[11]。

1.3铝盐+TLR9配体[CpG寡脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotide，ODN)] CpG ODN是在细菌基因组中发现的可被TLR9识别的核苷酸序列。B类CpG ODN可强烈刺激人B细胞和单核细胞的成熟，而被用于疫苗佐剂[12]。CpG+铝盐的组合用于HBV疫苗、炭疽疫苗和流感疫苗，缩短了保护性水平抗体产生的时间并且升高抗体滴度，诱导IFN-γ表达，激活Th1细胞免疫应答[13-15]。还能减少疫苗剂量，且CpG+铝盐的组合具有良好的耐受性。CpG和铝盐与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)重组抗原联用，可通过增加浆细胞的数量，提高免疫反应的效率，增强小鼠的体液免疫[16]。Tian等[17]发现将抗原与铝盐-CpG-天然免疫调节肽(Innate defense regulator peptide，IDR)-HH2组合佐剂共同施用明显激活NK细胞毒性，诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，显著引发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)应答，并增加肿瘤中的浸润淋巴细胞，有效抑制肿瘤生长并减少肿瘤负荷。Mirotti等[18]发现在卵清蛋白致过敏性肺炎模型中，铝盐/CpG具通过MyD88和IL-10改变铝佐剂所诱发的单一TH2型应答，导致平衡的TH1/TH2型免疫反应。

1.4铝盐+TLR7/8配体(3M-052) 磷酸基或阴离子电荷可促进对氢氧化铝的吸附，与TLR4配体(通常含有磷酸基)或TLR9配体(带负电荷)相比，其他的模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)配体比如TLR7/8激动剂Imiquimod不包含这种促进吸附的结构。对于不溶性脂质PRR配体来说，处理更加复杂，必须在与铝盐进行吸附之前，先将其配制成水悬液。Vasilakos等[19]开发了一种不溶性的合成TLR4配体—葡萄糖脂质A(Glucopyranosyl lipid A，GLA)的水纳米悬浮体(Aqueous formulation，AF)GLA-AF，并与磷脂酰胆碱结合，其通过磷酸配体交换来吸附氢氧化铝。Cortez 等[20]也通过用磷酸盐化学修饰TLR7激动剂苯并萘啶，使其可吸附于铝盐。

Fox等[21]提出了一种假设：辅助脂质可以促进不溶性PRR配体对氢氧化铝的吸附。即使PRR配体不含磷酸盐或其他阴离子基团，并用3M-052-AF(TLR7/8配体3M-052和辅助脂质二甲酰甘油酯的水纳米悬浮液)和铝盐联合肺结核抗原或HIV抗原，证明可以增强抗体水平和TH1型细胞免疫。

2 以乳剂为载体的复合佐剂

PELC是一种新型的纳米乳剂，由生物可吸收的聚合物PEG-b-PLACL、Span85和角鲨烯组成[22]。Huang等[23]证明了PELC在模拟体内环境可降解并具耐受性，所荷载的抗原在基质中持续释放，诱导高浓度的特异性抗体的产生，并极大地增强抗原特异性T细胞应答。此外，PELC不仅将APC募集到注射部位，而且还诱导募集的APC活化并迁移到引流淋巴结。Chen等[24]发现相比于铝剂，PELC/CpG能使重组H7HA(rH7HA)亚单位疫苗引发更高的病毒中和抗体表达，并且在脾中诱导更多的H7HA特异性IFN-γ分泌性T细胞和抗体分泌细胞，提高机体对H7N9型禽流感病毒的免疫能力。PELC/CpG佐剂还可用于一种新的肿瘤相关抗原L6的B细胞表位及CTL、TH表位嵌合长肽的配制，这种合成肽可应用于癌症免疫治疗[25]。

此外一种新型的O/W纳米乳剂(Nanoemul-sion，NE)W805EC，由大豆油(64%)和十六烷基吡啶(1%)、吐温80(5%)和乙醇(8%)在水中高速乳化制成，且平均粒径为350 nm。NE是一种新型黏膜佐剂，可诱导强大的IgA和IgG抗体反应以及特有的TH1/TH17细胞免疫。在基因敲除的小鼠中发现其可能同时通过TLR依赖和非依赖性的途径来诱导适应性体液和细胞免疫[26]。Bielinska等[27]通过用铝佐剂使乙肝表面抗原在小鼠肌肉内免疫建立TH2免疫应答，随后用NE-乙肝表面抗原免疫一次，发现 TH1相关免疫应答和IL-17表达增多，TH2细胞因子(IL-4和IL-5)和IgG1降低。NE免疫诱导调节性T细胞和IL-10，且IL-10是抑制TH2免疫的。这表明基于NE的疫苗可以降低已有的TH2免疫应答并促进TH1/TH17免疫应答。

3 以脂质体为载体的复合佐剂

脂质体是由胆固醇和磷脂组成的单个或多个双分子膜囊，无免疫刺激作用和毒性，可被生物降解。抗原可镶嵌在膜表面或包裹在膜内，发挥仓库效应和靶向作用。免疫增强性重组流感病毒体(Immunopotentiating reconstituted influenza virosomes,IRIV)由70%的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(构成磷脂双分子层)和30%的提纯于流感病毒中的糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuramini-dase，NA)(插在磷脂膜表面)组成[28]。HA与巨噬细胞的唾液酸受体结合，介导抗原进入由HA触发膜融合巨噬细胞的细胞质，NA可降低宿主黏液的黏性，使抗原更易接近宿主上皮细胞[29]。IRIV已经应用于流感疫苗和甲型肝炎疫苗中，甲肝抗原经纯化、灭活后结合在IRIV磷脂膜表面。

免疫刺激复合物是由皂苷、胆固醇、磷脂组成的直径约30～40 nm的脂质小泡，可促进抗原的呈递，增加抗体滴度的同时诱导细胞免疫应答，现已用于多种疫苗如 HIV疫苗、流感疫苗等[30]。Fox等[31]通过将TLR7的配体Imiquimod置于脂质体内部，将TLR4配体GLA插入脂质双层，发现与只含有一种TLR激动剂相比，在脂质中组合两种激动剂更易引发TH1型免疫且稳定期提升至一年以上。

4 非载体佐剂的复合化

4.1TLR7/8配体(3M-052)+TLR9配体(CpG ODN) TLR7/8激动剂3M-052和TLR9激动剂CpG ODN都可触发天然免疫反应，继而诱发肿瘤特异性免疫[32,33]。之前的研究表明这些激动剂单独使用可以提高小肿瘤患者的存活率但对大/晚期肿瘤的治疗效果有限。Zhao等[34]使实验鼠荷同种基因肿瘤，在肿瘤达到500～800 mm3之后，分别在瘤内注射3M-052、CpG ODN和CpG ODN+3M-052，并对抗肿瘤免疫和肿瘤生长进行了评价。发现联合使用时导致肿瘤浸润CTL和NK细胞的募集增加，减少髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)的数量，并显著减小肿瘤体积，同时提供长期保护防止肿瘤再生。

4.2TLR9配体(CpG ODN)+TLR3配体[poly(I∶C)] Whitmore等[35]最早验证了poly(I∶C)与CpG ODN合用可以增强对天然免疫细胞的刺激；通过诱导一氧化氮的产生及诱导型一氧化氮合酶、IL-1β、IL-6、IL-8和巨噬细胞炎症蛋白的表达，在鸡单核细胞中诱导比单独使用poly(I∶C)或CpG ODN时更强烈且持续时间更长的促炎反应[36]。将poly(I∶C) 与CpG ODN联合用于癌症治疗时，应交替而非同时使用，因为CpG的硫代磷酸酯修饰作用会阻断poly(I∶C)进入肿瘤细胞[37]。混合佐剂CpG ODN+poly(I∶C)增强了东部马脑炎病毒DNA疫苗的免疫原性，并在接种的小鼠中显著增强IL-2、IL-4和IFN-γ高水平分泌的CD4+T细胞应答，也增强CD8+T细胞对IL-2和IFN-γ的反应[38]。

4.3TLR4配体(MPL)+ T细胞共刺激分子(Streptavidin-4-IBB ligand，SA-4-1BBL) 基于肿瘤相关抗原的疫苗由于其免疫原性弱以及在晚期肿瘤中各种活跃的免疫逃避机制，其治疗效果有限。Srivastava等[39]联合应用两种不同类型的佐剂SA-4-1BBL和MPL，将它们不同的免疫细胞靶点、信号通路以及活化细胞免疫反应的作用相结合，发现在无毒性的情况下，疫苗在实验模型中可根除肿瘤。SA-4-1BBL/MPL佐剂组合的效应与活化树突状细胞(Dendritic cell，DC)、增加CD8+T细胞在肿瘤中的浸润、显著减少CD4+CD25+Foxp3+T调节细胞有关。进一步的研究发现，组合佐剂中的MPL与DC上的TLR4结合使其活化，上调共刺激受体/配体和各种促炎因子如IL-12、IL-16和IFN-γ，从而启动适应性T细胞免疫应答。SA-4-1BBL通过与DC上的受体结合活化DC、克服T调节细胞介导的免疫抑制来增强MPL的作用，与CD8+T细胞上的受体结合可使其增殖、分化、转化为致敏T细胞，并建立长期记忆[40]。

5 展望

佐剂的复合化可以在提高抗原免疫原性、免疫应答强度、免疫记忆以及减少免疫耐受等方面发挥更好的效果，同时利于控制副作用。尤其肿瘤疫苗的发展面临着两大障碍：免疫抑制和抗原性差，复合佐剂应用于肿瘤疫苗是最有希望规避这些障碍的方法[41]。新型佐剂组合可以通过激活多种免疫细胞和免疫机制，产生协同效应来增强免疫应答。