桑黄菌发酵酱渣生产黄酮和蛋白质的培养基优化

檀鑫榕，陈舒婷，冉早红，郝梦凡，金红

（天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

食用菌深层发酵不仅菌丝体生长速度快、营养利用率高，而且在发酵液中还含有相当丰富的初级代谢产物（如蛋白质、多糖）和次级代谢产物（如黄酮、抗菌素等）[1-4]。桑黄（Phellinus igniarius）学名鲍氏层孔菌，属于担子菌亚门，层菌纲，多孔菌科的药用真菌，是目前国际公认的抗肿瘤效果最好的药用真菌之一[5-7]。现已证明，桑黄含有多种药理成分，如多糖、黄酮、香豆素等[8-12]，且在发酵过程中也会产生蛋白和黄酮等物质，这些为富含蛋白质和黄酮类物质的新型食品和生物制剂的开发提供了参考。芝麻酱渣作为香油制备过程中的废弃物，成本低廉，多作为肥料和饲料使用，商品价值低[13]。其富含蛋白质，脂肪和磷等元素，是很好的培养基基质，同时兼顾有碳源和氮源的基质，若将其添加到食用菌发酵培养基中，必将为芝麻酱渣的深度利用开辟新的途径[14-15]。目前，桑黄在国际市场上供不应求，野生桑黄资源有限，桑黄的人工栽培研究在国内又刚刚起步，所以探索桑黄固体发酵既可以生产特色饲料也可以培养桑黄菌株，有广阔的市场前景[16-17]。以桑黄菌（Phellinus igniarius，锈革孔菌属多孔菌科）为材料，将芝麻酱渣以一定比例添加到桑黄菌的深层发酵培养基中，经过发酵利用，测定发酵液中黄酮和可溶性蛋白的含量及菌丝体干重，通过正交试验和多指标综合平衡[18-22]。通过查阅文献，筛选出桑黄菌深层发酵生产黄酮、可溶性蛋白、菌丝体干重三指标均较高的优化培养基配方[23-24]，以期为我国桑黄菌的开发提供参考，为芝麻酱渣的深度利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

桑黄菌种：由天津农学院生物技术实验室提供。芝麻酱渣：天津市红旗农贸批发市场，80℃烘干，粉碎，过60目筛，备用。

1.2 试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4、KH2PO4：天津市英博生化试剂有限公司；槲皮素对照品、考马斯亮蓝G-250：鼎国生物技术有限公司，均为国产分析纯。

1.3 仪器

BCM-1000A双人双面超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Neofuge 13R型台式高速冷冻离心机：力康发展有限公司；LDZX-40SCI型立式电热自动压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ARC-120型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；PH050A型生化培养箱：上海一恒科技有限公司；HY-5型回旋振荡器：金坛市盛蓝仪器制造有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 方法

1.4.1 培养基制备

固体斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%[14]；液体种子培养基I：葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、pH自然；液体种子培养基II：麦麸6%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%、pH值。

1.4.2 接种及培养

将0.5 cm2菌块接入固体斜面培养基，27℃培养至长满菌丝。用接种铲取两块0.5 cm2左右的菌块转接入液体培养基I中，25℃恒温培养箱48 h，之后转入摇床在25℃、150 r/min下进行液体培养，直至有均匀菌球长出。此时培养出来的菌体即为一级菌种。将一级菌种按接种量5%接入液体种子培养基II中，培养至菌球均匀，该菌体为二级菌种。

1.4.3 菌丝体干重的测定

将桑黄菌发酵液于3 000 r/min离心10 min，过滤上清液后得到桑黄菌丝体，用蒸馏水洗涤菌丝体至无色，于恒温干燥箱中60℃下烘干至恒重，菌丝干重测定参照文献进行[14]。

1.4.4 黄酮及可溶性蛋白含量测定的标准曲线制作

取桑黄菌深层发酵5 d的发酵液3 000 r/min离心10 min，取上清液进行黄酮和可溶性蛋白的含量测定，采用张静[19]的方法进行。以槲皮素浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，在285nm波长下比色测定，绘出黄酮标准曲线，方程为y=36.800x+0.007 4，R2=0.996 7，具有良好的线性关系。以蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，在595 nm波长下比色测定，绘出标准曲线。得到回归线性方程为：y=5.8514x+0.0021；R2=0.997 1，具有良好的线性关系。发酵液中黄酮含量（mg/mL）=提取液浓度（mg/mL）×稀释倍数。发酵液中可溶性蛋白含量（mg/mL）=提取液浓度（mg/mL）×稀释倍数。

1.4.5 桑黄菌发酵最佳培养时间的确定

将9%的芝麻酱渣添加到液体种子培养基II中，桑黄菌接种量为5%。25℃、150 r/min培养7 d。从培养第2天开始每隔24 h取样一次。样品3 000 r/min离心10 min，取上清液，测定黄酮和可溶性蛋白的含量和菌丝体干重。确定桑黄菌发酵最佳培养时间。

1.4.6 培养基成分单因素条件的筛选

以发酵液中可溶性蛋白和黄酮含量及菌丝体干重为考察指标，分别摸索酱渣浓度、酵母浸膏浓度、无机盐MgSO4和KH2PO4浓度等单因素的影响。

1.4.6.1 酱渣浓度的影响

在液体种子培养基II的基础上分别添加不同浓度的芝麻酱渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5 d。测定酱渣浓度对黄酮、可溶性蛋白含量和菌丝体干重的影响。

1.4.6.2 酵母浸膏浓度的影响

在液体种子培养基II的基础上分别添加不同浓度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5 d。测定酵母浸膏浓度对黄酮和可溶性蛋白含量的影响和菌丝体干重的影响。

1.4.6.3 MgSO4和KH2PO4的浓度影响

在液体种子培养基II的基础上分别添加不同浓度的 MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5d。测定MgSO4和KH2PO4浓度对黄酮和可溶性蛋白含量的影响和菌丝体干重的影响。

1.4.7 正交实验设计及验证实验

在单因素试验基础上，按照表1设计正交设计因素表，分别以黄酮和蛋白质含量及菌丝体干重为检测指标，获得正交结果，利用SPSS17.1软件处理和多指标平衡法获得最佳配方，在最佳配方基础上，进行三组平行验证试验。

1.4.8 数据分析方法

采用SPSS17.1软件处理。

2 结果与分析

2.1 最佳培养时间的确定

通过考察不同发酵时间对桑黄发酵生产黄酮和可溶性蛋白质含量、菌丝体干重的影响，找出最佳培养时间，结果见图1～图3。

图1 不同发酵时间对桑黄发酵液中黄酮含量的影响Fig.1 Effect of different fermentation time on the production of flavonoids in fermentation of Phellinus igniarius

图2 不同发酵时间对桑黄发酵液中可溶性蛋白质含量的影响Fig.2 Effect of different fermentation time on the production of soluble protein content in fermentation of Phellinus igniarius

图3 不同发酵时间对发酵液中桑黄菌菌丝体干重的影响Fig.3 Effect of different fermentation days on the production of mycelium dry weight of Phellinus igniarius fermentation

从图1可见，发酵液中黄酮含量在培养第5天时达到最大值；从图2可见，发酵液中蛋白质含量的变化有所不同，在培养第2天时，蛋白质含量比第3天时高，之后又开始上升直至达到最大值，即培养第5天时。分析原因可能是培养初期培养液中含有酱渣所致，酱渣中含有一定量蛋白质，但随着培养基消耗培养液中的营养消耗，之后再回升才是真正发酵引起的；从图3可见，发酵液中菌丝体干重在培养第5天时达到最大值。综合3个指标，最佳培养时间确定为培养第5天。

2.2 培养基配方的单因素摸索结果

2.2.1 酱渣浓度的影响

在液体种子培养基II中分别添加不同浓度的芝麻酱渣（0%、3%、6%、9%、12%、15%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5 d。测定酱渣浓度对黄酮、可溶性蛋白含量和菌丝体干重的影响，结果见图4～图6。

图4 不同浓度芝麻酱渣对桑黄菌深层发酵液中黄酮含量的影响Fig.4 Effect of different concentration of sesame sauce residue on flavonoids content produced in fermentation broth

图5 不同浓度芝麻酱渣对桑黄菌深层发酵液中可溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effect of different concentration of sesame sauce residue on the content of soluble protein produced in fermentation broth

图6 不同浓度芝麻酱渣对桑黄菌深层发酵液中菌丝体干重的影响Fig.6 Effect of different concentration of sesame sauce residue on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

从图4～图6中可以看出，黄酮含量、可溶性蛋白含量及菌丝体干重随着酱渣浓度的升高先上升后下降。酱渣浓度为9%时，黄酮含量达到最大值2.112 mg/mL，可溶性蛋白含量达到最大值1.365 mg/mL，菌丝体干重达到最大1.34 g。综合分析得到最优酱渣浓度为9%。

2.2.2 酵母浸膏浓度的影响

在液体种子培养基II分别添加不同浓度的酵母浸膏（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5 d。测定酵母浸膏浓度对黄酮和可溶性蛋白含量的影响和菌丝体干重的影响，结果见图 7～图 9。

图7 不同浓度酵母浸膏对桑黄菌深层发酵液中黄酮含量的影响Fig.7 Effect of different concentration of yeast extract on flavonoids content produced in fermentation broth

图8 不同浓度酵母浸膏对桑黄菌深层发酵液中蛋白质含量的影响Fig.8 Effect of different concentration of yeast extract on the content of soluble protein produced in fermentation broth

图9 不同浓度酵母浸膏对桑黄菌深层发酵液中菌丝体干重的影响Fig.9 Effect of different concentration of yeast extract on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

从图7～图9中可以看出，黄酮含量、可溶性蛋白含量和菌丝体干重随着酵母浸膏的升高先上升后下降。酵母浸膏为0.4%时，黄酮含量达到最大值1.211mg/mL，可溶性蛋白含量达到最大值1.352 mg/mL，菌丝体干重达到最大值1.25 g。综合分析得到最优酵母浸膏浓度为0.4%。

2.2.3 不同浓度MgSO4和KH2PO4的影响

在液体种子培养基II分别添加不同浓度的MgSO4（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）和KH2PO4（0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%），接种量为5%。25℃、150 r/min培养5 d。测定MgSO4和KH2PO4浓度对黄酮和可溶性蛋白含量的影响和菌丝体干重的影响，结果见图10～图15。

图10 不同浓度MgSO4对桑黄菌深层发酵液中黄酮含量的影响Fig.10 Effect of different concentration of MgSO4on flavonoids content produced in fermentation broth

图11 不同浓度MgSO4对桑黄菌深层发酵液中蛋白质含量的影响Fig.11 Effect of different concentration of MgSO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

图12 不同浓度MgSO4对桑黄菌深层发酵液中菌丝体干重的影响Fig.12 Effect of different concentration of MgSO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

从图10～图12中可以看出，黄酮含量、可溶性蛋白含量和菌丝体干重随着MgSO4浓度的升高先上升后下降。MgSO4浓度为0.1%时，黄酮含量达到最大值1.27 mg/mL，可溶性蛋白含量达到最大值1.23 mg/mL，菌丝体干重在MgSO4浓度为0.15%时达到最大值1.24 g。综合分析得出最优MgSO4浓度为0.1%。从图13～图15中可见，黄酮含量、可溶性蛋白含量和菌丝体干重随着KH2PO4浓度的升高先上升后下降。KH2PO4浓度为0.25%时，黄酮含量和菌丝体干重达到最大值分别为1.28 mg/mL和1.35g，可溶性蛋白含量在KH2PO4浓度为0.20%和0.25%时相差不大，达到最大值1.38 mg/mL，综合分析得出最优KH2PO4浓度为0.25%。

图13 不同浓度KH2PO4对桑黄菌深层发酵液中黄酮含量的影响Fig.13 Effect of different concentration of KH2PO4on flavonoids content produced in fermentation broth

图14 不同浓度KH2PO4对桑黄菌深层发酵液中蛋白质含量的影响Fig.14 Effect of different concentration of KH2PO4on the content of soluble protein produced in fermentation broth

图15 不同浓度KH2PO4对桑黄菌深层发酵液中菌丝体干重的影响Fig.15 Effect of different concentration of KH2PO4on dry weight of mycelia produced in fermentation broth

2.3 正交试验结果

2.3.1 正交试验因素表

根据筛选出的单因素结果，进行四因素四水平正交试验，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素表Table 1 Four factors and four levels orthogonal test

2.3.2 正交试验结果

按照表1设计的正交试验因素表进行四因素四水平的正交实验，以黄酮和蛋白质含量及菌丝体干重为测定指标获得结果，并采用SPSS17.1软件处理试验数据，结果见表2。

表2 四因素四水平正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test of four factors and four levels

从表2可见，以黄酮含量为考察指标，得到的最优培养基配方为A4B3C4D1；以蛋白质含量为考察指标，得到的最优培养基配方为A4B2C1D1；以菌丝体干重为考察指标，得到的最优培养基配方为A4B3C4D3。各个培养基配方稍有不同。为了得到3个指标均较好的配方，采用综合平衡法进行多指标分析，筛选获得能兼顾黄酮和可溶性蛋白、菌丝体干重3个指标均衡的培养基优化方案。

2.3.3 多指标综合分析法获得优化配方

对因素A和C的分析：对三指标A4水平均最好；对因素B的分析：对于黄酮含量和菌丝体干重来说，B3水平最好。对于可溶性蛋白质来说，B2水平最好，B3水平次之，综合3个指标，选择B3水平；对因素C的分析：对于可溶性蛋白含量和菌丝体干重来说，均以C4最好，对于黄酮含量来说，C1水平最好，C4水平次之，综合因素C选择C4水平；对D因素的分析：对于黄酮含量和菌丝体干重说，D1水平最好。对于蛋白质含量来说，D3水平最好，D1水平也不差，综合分析选择D1。根据综合平衡法，筛选出的最优培养基为配方为A4B3C4D1，即：酱渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%。

2.3.4 验证试验

按照最优配方进行3组平行验证试验，测得黄酮含量为2.033 mg/mL、可溶性蛋白质的含量1.667 mg/mL，菌丝体干重为1.866 g。

3 讨论与结论

芝麻酱渣中含有丰富的营养物质，可以作为食用菌液体发酵培养基的主要成分，但芝麻酱渣含有大量的盐分，添加过多会抑制食用菌的生长[13]。试验用的酱渣是芝麻磨成油之后的副产品，本身含有的营养物质在菌体发酵过程中菌体得以应用，菌体长势良好。芝麻酱渣可以代替麦麸作为桑黄菌液体发酵的培养基成分，并且添加后黄酮与可溶性蛋白的含量均较高，生产成本低。

桑黄发酵添加9%芝麻酱渣后，黄酮和可溶性蛋白的含量及菌丝体干重较其他酱渣浓度下高。最佳发酵时间为第5天。以黄酮和可溶性蛋白质含量及菌丝体干重为多指标筛选出的最佳培养基配方为：芝麻酱渣12%、酵母浸膏0.4%、KH2PO40.25%、MgSO40.05%，经过3次平行验证试验，得到黄酮的含量为2.033 mg/mL，可溶性蛋白质的含量为1.667 mg/mL，菌丝体干重为1.866 g。