鲍鱼内脏酶解液抗氧化能力及脱腥工艺研究

梁杰，赵晓旭，杨志强，汪少芸

（1.莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建莆田351100；2.福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

海洋生物体内存在许多珍贵的天然生物活性物质[1]，因生活环境与陆地环境的巨大差异（低温、高压、高盐度、避光、低氧）而具有结构新颖、功能特殊的生物学特性[2-3]。各国科学研究者已经从海洋动物、植物、微生物中分离出各种生物活性物质[4-9]，其中一些已经通过临床验证并已成功上市，深受广大消费者喜爱和好评。鲍鱼（abalone）贵为“海珍之冠”，是一种优质的动物蛋白，研究表明，其内脏和肌肉中生物活性成分相似，含有丰富的蛋白质、氨基酸、牛磺酸、多糖等营养元素，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫力及促进皮肤胶原蛋白再生、维持生理代谢等保健功能，鲍鱼内脏（性腺）酶解物中氨基酸种类齐全，且具有良好的抗氧化能力，具有较高的研发价值[10]。由于海产品的生存环境，使其具有浓重的腥臭味，而这种令人厌恶的特征，影响水产蛋白酶解产物的开发应用。酶解液中存在的苦腥味主要是由于酶解过程产生含疏水基团的短肽和疏水性氨基酸，目前脱腥脱臭的方法主要为：物理吸附法、β-环糊精包埋法（β-Cyclodextrins，CDs）、酶法、微生物法、抗氧化剂法、萃取法、掩盖法、微胶囊法、蒸气脱腥法、酸碱处理法、高压脉冲电场法等[11-12]。

本文在前期试验基础上制备得到鲍鱼内脏粗蛋白，以抗氧化能力和水解度为指标通过单因素和正交试验确定最佳酶解条件，得到具有较强抗氧化能力的酶解液；以食品级活性炭粉末为吸附剂，以蛋白质回收率和感官评价为指标，对酶解液进行脱腥去苦工艺优化（包括活性炭添加量、吸附时间、温度等因素），确定最佳工艺参数。将水产品加工下脚料变废为宝，制备抗氧化肽[13]，为提高鲍鱼产品附加值和资源利用率提供了新思路，为推动海产品精深加工及开发相关保健品提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验原料

鲍鱼内脏：福建莆田城南市场。

1.1.2 试验试剂

木瓜蛋白酶：诺维信（中国）生物技术有限公司；活性炭：莱阳市康德化工有限公司；其它化学试剂：国产分析纯；试验过程用水：均为去离子水。

1.2 仪器与设备

FD-1B-55型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器公司；UV2550紫外/可见分光光度计：日本岛津公司；DHG-9030A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏公司；MDF-U333型超低温冰箱：日本三洋公司；PB-10型精密数显酸度计：赛多利斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解工艺

1.3.1.1 酶解液的制备

鲍鱼粗蛋白粉（冷藏）→加水搅拌至完全溶解→最佳酶解条件，充分酶解→100℃下灭酶10 min→静置冷却后10 000 r/min速率离心分离10 min，取上清液→酶解液，待测。

1.3.1.2 水解度的测定

参照文献[14-15]通过甲醛滴定法测定。

1.3.1.3 DPPH自由基清除率的测定

参照文献[16]的方法测定DPPH自由基清除率。

1.3.1.4 单因素试验

参考文献[17]并在前期大量探索试验的基础上，以水解度和自由基清除率为评价指标，分别考察酶/底物（[E]/[S]）（400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 U/g）、底物浓度（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%）、酶解时间（1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）、酶解温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）、pH 值（分别调节为 4、5、6、7、8、9、10）等条件对酶解效果的影响，确定各因素的适宜范围。

1.3.1.5 正交试验

在单因素试验的基础上，综合考虑各因素之间的互相影响，选择酶/底物（U/g）、酶解温度（℃）、底物浓度（%）、pH值4个因素3个水平进行优化，做四因素三水平L9（34）的正交试验分析。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factor levels table of orthogonal test

1.3.2 脱腥除臭工艺

将食品级的活性炭粉末按一定比例加入酶解液中，充分搅拌，调节pH值，将其置于一定温度水浴摇床中，吸附反应一定时间，经4 000 r/min离心10 min，测定上清液中蛋白质回收率并进行感官评定。在前期预试验的基础上并参考文献[18]，以蛋白质回收率和感官评定腥味值为指标，通过活性炭添加量（0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、吸附时间（0、20、40、60、80、100、120min）、吸附温度（10、20、30、40、50、60℃）等单因素进行试验，在此基础上进行正交试验，优化酶解液的脱腥脱臭工艺参数。因素水平表见表2。

表2 正交因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2.1 蛋白质回收率的测定

用凯氏定氮法分别测定酶解液经活性炭吸附前和吸附后的蛋白质含量，计算蛋白质回收率。

式中：Pro1为脱腥液的蛋白质含量，mg；Pro2为酶解液的蛋白质含量，mg。

1.3.2.2 腥味感官评定方法

人类天生具有灵敏的嗅觉，能够察觉分析仪器无法检测的低浓度气味物质的存在，例如能觉察出在1 m3空气中有4×10-5mg甲基硫醇，仪器却无法检测到[19]。在食品风味研究中，感官评定是最简单、直观的方法，感官评分为最常用的方法。腥味感官评定由预先培训的10名固定的感官评定人员组成，采用先闻后尝的方式，为不影响评定结果，测评过程中不允许交流和讨论。分别对试验样品的腥味、苦味、外观颜色进行综合测评，以去离子水为对照（分值为0分），评分标准如表3 所示[19-20]。

表3 评分标准Table 3 Standards for sensory evaluation

2 结果与分析

2.1 最佳酶解条件的确定

多肽的抗氧化能力与水解度、分子量分布、氨基酸组成等因素密切关联，研究酶解参数条件，如底物浓度、酶解温度、酶/底物、酶解时间、pH值等因素，对于获取具有较强抗氧化能力的活性肽至关重要[21]。前期试验提取得到鲍鱼内脏粗蛋白冻干粉。在前期大量试验摸索的基础上，以水解度和抗氧化能力为指标，选用木瓜蛋白酶为工具酶；以水解度（DH）和DPPH自由基清除率为评价指标，分别考察底物浓度、酶解温度、酶/底物、酶解时间、pH值对木瓜蛋白酶酶解效果的影响。

2.1.1 酶解条件单因素试验

酶/底物、底物浓度对酶解效果及DPPH自由基清除率的影响见图1所示，酶解时间、酶解温度、pH值对酶解效果及DPPH自由基清除率的影响如图2所示。

图1 酶/底物（A）、底物浓度（B）对酶解效果及DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of[E]/[S]（A），substance concentration（B）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

2.1.1.1 酶/底物对鲍鱼源抗氧化肽酶解效果的影响

图2 酶解时间（A）、酶解温度（B）、pH值（C）对酶解效果及DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of time（A），temperature（B），pH value（C）on eymohydrolysis and DPPH racial clearancing activity

由图1（A）可知，随着酶/底物的增加，酶解液水解度出现先增加后减小的趋势，在酶/底物为400 U/g～1 200 U/g时，酶解液水解度不断提高，在酶/底物即[E]/[S]为 1 200 U/g时水解度达到最大值（16.55±0.32）%；这是由于蛋白质浓度一定的情况下，体系内酶解效率随着酶添加量的不断增加而提高，酶解效率越高，则水解度也就相应的越大，当水解反应进行到一定程度，底物被饱和，酶的数量出现过剩的情况，此时水解速率几乎保持稳定的状态。一般认为，[E]＜＜[S]时，酶反应速率与底物浓度呈正比关系，反应到一定时间之后随着[E]/[S]增加，水解度变化不明显。DPPH自由基清除率随着酶/底物增加不断增大，当酶/底物达到1 200 U/g时DPPH自由基清除率达到最大值（79.76±0.97）%，即酶解液抗氧化活力达到最大值；之后酶/底物继续增加到1 800 U/g，DPPH自由基清除率出现下降的趋势，该现象的产生可能是由于随着酶解反应的进行，越来越多的蛋白被水解成小片段肽，DPPH自由基清除率不断上升，而当水解达到一定程度时，出现过度水解反应导致部分具有抗氧化活性的肽段被酶解而失去抗氧化能力，且蛋白酶本身也是一种蛋白质，自身发生酶促反应干扰反应体系；这与姚翔的研究相一致，他通过中性蛋白酶和氨肽酶酶解紫菜蛋白，酶解产物的DPPH自由基清除率也随着加酶量的增加先增大后降低[22]。综上所述，以抗氧化能力为参考指标，兼顾生产成本和水解度的因素，选择酶/底物为1 200 U/g为最佳水平。

2.1.1.2 底物浓度对鲍鱼源抗氧化肽酶解效果的影响

结果如图1（B）所示，随着底物浓度的增大水解度出现先升高后降低的趋势，在底物浓度为6%时达到最大为（14.41±0.56）%。这是因为底物浓度较小时底物蛋白过于分散，影响酶促反应的进行，使得酶解反应效率较低，因此水解度在反应开始阶段呈现较低的情况；随着底物浓度不断增加，加快体系中生物大分子如蛋白质和酶在水中的自由扩散，促进酶促反应的有效进行，水解度高；底物浓度过大，反应体系的黏度液相应变大，体系流动性差，造成底物蛋白与蛋白酶活性部位无法得到有效结合，使得底物蛋白与木瓜蛋白酶的接触不够完全，抑制酶解反应的进行[23]。当底物浓度为1%～6%时，酶解液清除DPPH自由基的能力也不断升高，在底物浓度为6%时清除率达到最大值（84.15±0.34）%，这是因为底物浓度越大，参加反应的底物蛋白也越多，产生的抗氧化肽段比例也越高，所以抗氧化能力呈现上升的趋势；当底物浓度达到一定值时，酶解反应能够有效利用的酶均结合在反应位点上，没有多余的酶与底物蛋白相结合，此时即使不断增加底物浓度，酶解液的抗氧化能力仍然维持在一定水平不再升高。刘丹用Alcalase碱性蛋白酶制备大豆抗氧化肽，底物浓度添加量与自由基清除率的关系也呈现一样的变化趋势[24]。综上所述，选择底物浓度6%为最佳用量。

2.1.1.3 酶解时间对鲍鱼源抗氧化肽酶解效果的影响

由图 2（A）可知，酶解时间为 1.0 h～5.0 h 时，水解度呈现不断上升的趋势，在3.5小时后水解度仍然呈上升趋势但增幅开始减缓，这是因为随着酶解时间的增加，酶对专一性的肽键水解达到饱和，且随着反应的不断进行，底物浓度不断减低，产物浓度不断累积增加，酶的竞争性抑制趋于稳定[25]。在酶解过程进行到第4小时时，酶解液DPPH自由基清除率达到最大值（83.76±0.31）%，这可能与目的产物抗氧化肽被过度水解，导致具有抗氧化活性的肽段被切割而降低抗氧化能力有关。综上所述，以DPPH自由基清除率为评价指标，兼顾生产时间成本，选择酶解时间为4.0 h为最佳酶解时间。

2.1.1.4 酶解温度对鲍鱼源抗氧化肽酶解效果的影响

结果如图2（B）所示，随着酶解温度的升高，酶解液水解度也呈升高的趋势，而DPPH自由基清除率在温度达到40℃后则没有显著变化。在酶促反应进行过程中，温度是影响较大的因素之一，温度升高，反应加快，因而水解度升高，温度降低，反应速度减慢。由图2（B）可知，60℃为抗氧化能力最大时的酶解温度。

2.1.1.5 pH值对鲍鱼源抗氧化肽酶解效果的影响

结果如图2（C）所示，随着pH值增加酶解液水解度不断升高，在pH值为8时达到最大值（15.01±0.55）%，pH值继续增大，即溶液体系开始变为偏碱性时，水解度出现下降。pH值为7是木瓜蛋白酶的最适pH值环境，此时水解度和抗氧化能力都尚未达到最大值。这是因为酶的最适pH值不是酶的特征物理常数，即不是一成不变的固定值，与酶和底物浓度、酶的作用时间、环境中pH值密切相关，酶与底物的结合和催化反应常取决于底物和酶分子的电荷分布，酶活性受pH值影响较为显著，蛋白质的电荷分布是由氨基酸序列中可解离的侧链状态决定，而这又与pH值相关，过酸或过碱都会影响其活性。在pH值为8的条件下，该体系酶促反应的效率最高，酶解液中抗氧化肽所占比例最大，此时DPPH自由基清除率为（85.67±0.92）%。综上所述，选择pH值为8酶解的最适pH值。

2.1.2 制备抗氧化肽的正交试验

分析单因素试验结果，选取酶/底物（U/g）、底物浓度（%）、pH值、酶解温度（℃）做四因素三水平L9（34）的正交试验分析，正交试验结果见表4，方差分析见表5。

表4 正交试验结果表Table 4 Orthogonal experiment and results

表5 方差分析表Table 5 Results of variance analysis

由表4中可知，4个因素中，对自由基清除率的影响主次排序为：C＞A＞D＞B，即影响抗氧化能力因素的主次顺序为：pH值＞酶/底物＞酶解温度＞底物浓度。通过正交优化分析得到最优组合为A1B1C3D2，正交表中实际自由基清除率最高的组合为A1B3C3D3，为获得最佳的抗氧化能力活性肽片段并从实际生产中节约成本的原则出发，选取A1B1C3D2为最佳试验方案。由表5可知，因素pH值对自由基清除率的影响具有显著性，酶/底物和底物浓度对自由基清除率的影响不显著。综上，本试验的优化组合为A1B1C3D2，即pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解温度60℃，底物浓度5%。

2.1.3 最佳条件的验证

控制反应体系处于最佳条件下，测定该条件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率为（88.14±0.92）%，与正交表4中的结果对比，确为最高，因此该工艺为制备鲍鱼抗氧化肽的最佳酶解条件。

2.2 脱腥脱臭工艺的优化

鲍鱼内脏蛋白酶解液是具有良好抗氧化能力的多肽片段，该水溶性蛋白水解产物存在着海产品特有的较为浓郁苦腥味。活性炭是一种常见的疏水性吸附剂，本研究采用活性炭为脱腥剂，以蛋白质回收率和感官评定腥味值为参考指标，通过考察脱腥剂用量、吸附pH值、吸附时间、吸附温度等单因素对脱腥脱臭效果的影响，旨在优化水产品脱腥脱臭的工艺参数，为工业化生产奠定试验基础。

2.2.1 单因素试验

活性炭添加量、pH值对蛋白质回收率和感官指标的影响如图3所示，温度、吸附时间对蛋白质回收率和感官指标的影响如图4所示。

2.2.1.1 活性炭质量分数的影响

图3 活性炭添加量（A）、pH值（B）对蛋白质回收率和感官指标的影响Fig.3 Activated carbon content（A），pH 值（B）influence on protein recuperation and sensory index

图4 温度（A）、吸附时间（B）对蛋白质回收率和感官指标的影响Fig.4 Temperature（A），Adsorption time（B）influence on protein recuperation and sensory index

活性炭质量分数对酶解液脱腥脱臭效果影响如图3（A）所示，随着活性炭添加量的增加，感官指标分值随着活性炭质量分数的增加而降低，表明活性炭去苦腥味效果良好；由于活性炭对蛋白也有一定的吸附能力，造成蛋白质回收率随着活性炭质量分数的增加而降低。为保证试验效果，既要腥味物质和色素分子能被活性炭最大限度吸附，又要避免蛋白多肽等活性物质被吸附造成物料损失，以蛋白质回收率兼顾腥味感官值为指标，活性炭添加量为1.0%时，蛋白质回收率可达到（84.34±0.45）%，此时腥味值为4.40，腥苦味相对较小。综上所述，本试验选择活性炭添加量为1.0%为最佳水平，并选取1.0%、1.5%、2.0%为后续正交试验中活性炭质量分数因素的3个水平。

2.2.1.2 pH值的影响

吸附体系pH值对酶解液脱腥脱臭效果影响如图3（B）所示，pH值对蛋白质回收率和感官评分值的影响显著，在酸性条件下，即pH值范围在2～6时，活性炭对体系的脱腥脱臭效果较为理想，且蛋白质回收率呈递增的趋势；当体系pH值从中性缓慢过渡到碱性时，即pH值范围在7～9时，蛋白质回收率呈缓慢增大的趋势，但活性炭的脱腥脱臭能力开始减弱，感官评定分值出现增加的情况。为兼顾蛋白质回收率和腥味感官值两个参考指标，选择吸附体系pH值6.0为最优水平，该水平下感官评定分值为3.45，此时蛋白质回收率可达（85.45±0.45）%。利用活性炭在体系酸碱性不同的条件下对色素的吸附和解析作用，可以循环利用活性炭[26]。综上所述，本试验选择pH 6.0为最佳水平。

2.2.1.3 吸附温度的影响

吸附温度对活性炭脱腥脱臭效果影响如图4（A）所示，在10℃～40℃时，感官评定分值呈递减的趋势，表明升高温度能够促进活性炭吸附酶解液中的色素分子，此时蛋白质回收率也呈递增的趋势，当温度为40℃时，蛋白质回收率为（88.13±0.32）%，此时腥味感官值最低，为3.61；当温度升高到60℃时，蛋白质回收率仅剩（70.25±0.47）%，此时腥味值也呈增大趋势；综合考虑，既要腥味物质和色素分子被活性炭吸附，同时要避免蛋白多肽等活性物质被吸附造成物料损失，同时考虑能耗因素，选择吸附温度为40℃为最佳水平，并选取30、40、50℃为后续正交试验中温度因素的3个水平。

2.2.1.4 吸附时间的影响

如图4（B）所示，当吸附时间在0～80 min时，蛋白质回收率随时间延长呈降低趋势，当时间为80 min～120 min时，活性炭吸附剂的对蛋白质的吸附开始趋于饱和，当时间为120 min时，蛋白质回收率仅剩下（77.44±0.98）%；当吸附时间为 0～60 min时，腥味感官值呈现降低的趋势，在60 min时腥味感官值达到最低值2.81，时间继续延长，此时感官腥味值受时间的影响趋于不明显。综上所述，考虑时间成本，选择吸附时间为60 min为最佳水平，并选取40、60、80 min为后续正交试验中时间因素的3个水平。

2.2.2 活性炭吸附正交试验结果

分析单因素试验，选取活性炭质量分数、pH值、吸附温度3个因素进行L9（34）正交优化试验。试验结果及分析分别见表6、表7、表8。

表6 正交试验设计及结果Table 6 The orthogonal design and results of anthrasorb odor treatment

表7 方差分析表（以蛋白质回收为指标）Table 7 Analysis of variance table（protein recuperation）

对因素C而言，它对感官值的影响最重要，故选因素C的第二水平，即C2；对因素B而言，选第一水平时其蛋白质回收率较低，最高仅为81.65%，而当选第二水平时，蛋白质回收率最高可达88.43%，故选因素B的第二水平，即B2；对因素A而言，它对蛋白质回收率的影响最重要，对感官值的影响次序排第二，当选因素A的第一水平时，蛋白质回收率最高可达88.57%，而选因素A的第二水平时，蛋白质回收率最高仅为83.11%，综合考虑，因素A选取第一水平为最合适，即A1。

表8 方差分析表（以感官值为指标）Table 8 Analysis of variance table（sense evaluate）

由方差分析表7、8可知，活性炭质量分数对蛋白质回收率影响显著，吸附温度对蛋白质回收率的影响不显著，归入误差项；吸附温度对腥味值的影响极显著，活性炭质量分数对腥味值的影响较显著，吸附时间对腥味值的影响不显著，归入误差项。

综上，本试验优化后的因素组合为A1B2C2，即食品级粉末活性炭的质量分数为1.0%，吸附时间为60min，吸附温度为40℃。在该条件下试验得到的蛋白质回收率为（88.06±0.24）%，腥味值为 2.00。

3 结论

鲍鱼内脏蛋白通过木瓜蛋白酶充分酶解，以抗氧化能力和水解度为指标进行单因素和正交试验得到最佳酶解条件：pH值9，酶/底物1 000 U/g，酶解温度60℃，底物浓度5%，该条件下酶解得到抗氧化活性肽其DPPH自由基清除率为（88.14±0.92）%，酶解液水解度为（14.12±0.53）%。海产品酶解液本身具有令人厌恶的苦腥味，因此选择食品级活性炭粉末作为吸附剂进行脱腥脱臭，以蛋白质损失率和感官评定为指标，得到活性炭最佳吸附工艺参数为：活性炭质量分数1.0%，吸附时间60 min，吸附温度40℃，该条件下得到蛋白质回收率为（88.06±0.24）%，腥味值为2.00，此时酶解液无明显苦腥味，液体澄清呈淡黄色，感官品质显著改善。