两种果酒酵母对杨梅果酒发酵及风味的影响

屠梦婷，陈琦，朱婉姣，孙辰茹，金清馨，张有做，许光治

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江临安311300）

杨梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我国南方特色水果，它属杨梅科乔木植物，果实香气怡人，呈棕褐色、紫黑色，酸甜适口而广受欢迎[1]。杨梅果肉中含有丰富的维生素、矿物质元素、胶、纤维素、蛋白质及人体所需的8种必需氨基酸；其铁、磷、钙的含量也非常高，约为其它水果含量的十倍以上而且具有食用、药用双重价值。由于杨梅果实成熟于高温多雨的季节，且其果实柔软多汁，无外果皮包裹，采后呼吸旺盛，因而不耐储运[2]，导致大量积压、腐烂。目前，杨梅的深加工产品多见于糖水罐头、蜜饯、果汁、饮料、果醋等产品[3-4]。

利用新鲜杨梅发酵的果酒，不仅保留杨梅本身的营养物质，而且发酵过程中产生的高级醇、酯、挥发性酸等物质赋予了果酒新的风味。杜晶等[5]对从杨梅树叶、果园土壤及杨梅自然发酵缪中分离筛选出适宜杨梅果酒发酵的酿造酵母及产香酵母进行菌种鉴定和耐受性研究。李洁莹等[6]对无醇杨梅果酒的发酵工艺进行优化，得出最适宜的发酵条件，并将无醇杨梅果酒与杨梅汁香气成分进行对比分析。徐安书等[7]对以葡萄酒活性干酵母为菌种制备杨梅果酒的最佳发酵工艺参数进行了考察。

果酒酿造中，酵母对果酒品质有重要影响。因此，酿酒的过程中选择一种合适的酵母不仅能提高果酒的口感和风味[8]，还可以提升果酒的品质[9]。杨梅果酒的发酵研究还主要集中于发酵酵母的筛选和工艺优化，关于不同酵母对杨梅果酒品质的影响还研究的较少。目前D254酵母和71B酵母在果酒酿造中运用较广，这两种果酒酵母产酒精能力强，酸度较低[10-11]。71B酵母在莲雾果酒的酿制中发酵速率快，具有较强的降酸功能，且色香味最佳，可作为莲雾果酒工厂化生产的酵母[12]。在干红樱桃酒酿制过程中，7株商业酿酒酵母只有酵母D254发酵效率高，且赋予果酒较佳的感官品质[13]。

本研究分析D254和71B这两种酵母对杨梅果酒发酵及风味的影响，以期为杨梅果酒的进一步开发及工艺优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杨梅：采于仙居东魁；酵母D254和酵母71B：上海瑞楚生物科技有限公司；无水碳酸钠、无水亚硫酸钠、苯酚、3，5-二硝基水杨酸、乙酸钠、氯化钾、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HR-3001B搅拌器：佛山艾诗凯奇电器有限公司；D-37520离心机：美国Sigma-Aldrich；pH-10酸度计：浙江力辰仪器科技有限公司；HWS-150恒温恒湿箱：上海精宏实验仪器设备有限公司；GCMS-QP210PLUS气相色谱-质谱联用仪、UV-1800紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 杨梅果酒的制作工艺及流程

杨梅果酒的制作工艺及流程主要参考侍崇娟等[14]方法并略作改动，如下：

杨梅汁处理：取冷冻杨梅解冻，经挑选去除霉变果后清洗，去核榨汁后离心（16 873×g）15 min，分别用0.65 μm和0.45 μm膜过滤，取过滤后杨梅汁30 mL，添加蔗糖至杨梅汁可溶性固形物浓度达到20%，用苹果酸调节pH值至3.5。

将酵母按质量分数为10%的接种量加至杨梅汁中进行主发酵。在25℃条件下发酵35 d，发酵过程中比较 0、2、4、7、14、21、35 d 这 7 个时间段中不同菌种发酵酒的酵母菌数量、总酸含量、还原糖含量、可溶性固形物含量以及花青素含量。发酵结束后对杨梅果酒取样进行香气成分分析。

1.3.2 杨梅果酒理化指标测定

总酸含量测定：参照Wojdylo A等[15]方法测定。可溶性固形物含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸比色法[16]测定。酵母细胞数量测定：采用平板计数法测定。花青素含量测定：参照孙晓伟等[17]方法测定。理化指标重复测定3次。

1.3.3 杨梅果酒挥发性香气成分测定

采用顶空固相萃取法（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）对杨梅果酒中的香气物质进行提现。取3 mL主发酵结束后的酒样至10 mL顶空瓶中，密封好后将经老化的萃取针插入样品顶空处，置50℃水浴中，待放稳后推出萃取针头，顶空萃取30 min后将萃取头插入气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）进样口，解吸3 min。

参照马腾臻等[18]方法并略作修改。

GC-MS条件：

色谱条件：RTX-5MS色谱柱（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；进样口温度250℃；升温程序：色谱柱初温40℃保持5 min，以6℃/min升至120℃，保持5 min后以5℃/min升至250℃，保持15 min；载气：高纯He；流速：3 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电子电离源；离子源温度230℃，接口温度250℃，质量扫描范围40 m/z～500 m/z。

1.4 数据统计分析

主要采用Excel2007、SPSS19.0等进行数据统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中酵母菌数量的动态变化

酵母在发酵过程中数量变化见图1。

图1 两种酵母酿造杨梅果酒酵母数量（浓度）随发酵时间的变化Fig.1 Changes of yeast number（concentration）in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast

酵母在发酵过程中数量变化如图1所示，酵母71B的数量在第2天快速增加至第7天达到最高值为1.43×108个/mL后有个缓慢减少的过程，最后基本达到平台期；而酵母D254在第2天快速增加至第7天后仍缓慢上升至第15天达到最高值为1.30×108个/mL但仍不及71B，到第15天之后，酵母D254生长基本至停滞状态，微生物数量变化很小。

2.2 杨梅果酒发酵过程中理化指标变化

在发酵过程中理化指标变化见图2。

图2 两种酵母酿造杨梅果酒理化指标的变化Fig.2 Changes of physical and chemical indexes in fermented waxberry wine with different fermentation time by two kinds of yeast

由图2可知，随着发酵时间的增长，总酸含量呈先上升至最大值后稍微下降至稳定趋势，还原糖含量、可溶性固形物含量和花青素含量均呈先下降后稳定的趋势，pH值控制在3.3～3.5且无明显变化，酵母菌比细菌耐酸，低pH值能抑制杂菌的生长，低pH值和高含量的有机酸有助于稳定颜色和口感[19]，提高杨梅果酒的质量。总酸度在杨梅果酒酿造中是一个重要的理化指标，它直接影响杨梅的颜色、口感和风味。酵母D254在杨梅果酒的发酵过程中总酸度迅速上升至第4天达到最大值为10.91g/L，随后下降至平台期。酵母71B在杨梅果酒的发酵过程中总酸度迅速上升到第4天后持续缓慢上升至第14天达到最大值为10.77 g/L，随后缓慢下降至平台期。与酵母D254相比，发酵结束后71B制得的果酒总酸含量明显高于酵母D254。另外，两种酵母在发酵酿制杨梅果酒过程中的可溶性固形物含量均持续下降至第14天后呈稳定趋势，整体变化趋势相似且基本无差异，相对而言71B含量较高。两种酵母在发酵酿制杨梅果酒过程中还原糖含量有明显的降低过程，整体变化趋势与可溶性固形物含量变化趋势相似且基本无差异。整个发酵过程中，杨梅果酒中的花青素（矢车菊花素-3-葡萄糖苷）含量呈递减趋势。原汁中花青素的含量为（0.501±0.013）g/L，酵母D254在杨梅果酒的发酵过程中花青素含量在前14天持续下降，第14天后花青素含量显著减少（P＜0.05），在第21天趋于稳定。酵母71B在杨梅果酒的发酵过程中花青素含量在前7天显著减少（P＜0.05）后持续缓慢下降，在第21天趋于稳定。酿酒过程结束时，由D254酵母发酵的杨梅果酒花青素含量为（0.201±0.009 7）g/L；由71B酵母发酵的杨梅果酒花青素含量为（0.231±0.016）g/L。

2.3 两种酵母酿造杨梅果酒香气成分的比较分析

发酵结束后不同接种发酵果酒中香气成分见图3和图4。

图3 果酒酵母D254发酵杨梅果酒香气成分GC/MS图谱Fig.3 Total ion current chromatogram of the aromatic components in waxberry wine fermented with yeast D254

图4 酵母71B发酵杨梅果酒香气成分GC/MS图谱Fig.4 Total ion current chromatogram of the aromatic components in bayberry wine fermented with wine yeast 71B

果酒的香气成分是水果（品种香气）、果酒发酵过程形成的次级代谢产物（发酵香味）和陈酿阶段形成的挥发性化合物的独特混合[20]。由于特定的酵母菌株可能有助于杨梅果酒的特征风味，并且还可以在发酵期间产生不同量的芳族化合物[21]，而这些芳香活性化合物的产生在不同酵母菌株之间存在高度的差异，因此，精心挑选具有最佳芳香族特征的菌株对于高质量的最终产品而言是至关重要的[22]。对2个图中任一峰面积相对强度不低于0.8%的共28种成分进行了分析，其中检测到D254发酵杨梅果酒22种香气成分、71B发酵杨梅果酒24种。两批杨梅果酒香气成分的比较分析及统计结果如表1所示。

表1 2种酵母发酵的杨梅果酒主要香气成分Table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts

通过GC-MS初步鉴定两种酵母发酵的杨梅果酒酒样中的28种香气成分（见表1），这些成分主要是醇类3种、酸类2种、酯类15种、醛酮类2种、烷烃、烯烃类3种、酚醚类1种以及其他类2种。

在酵母D254酿造的杨梅果酒中，共检测出22种香气成分，占总峰面积的97.17%。其中，醇类71.64%、酸类9.02%、酯类10.34%、醛酮类0.32%以及烷烃、烯烃类0.23%。其主要香气成分为3-甲基-1-丁醇、乙酸、甲氧基苯基肟和十六酸乙酯，相对含量分别为70.77%、7.96%、4.29%和3.43%。

在酵母71B酿造的杨梅果酒中，共检测出24种香气成分，占总峰面积的98.19%。其中，醇类72.49%、酸类4.05%、酯类16.22%以及烷烃、烯烃类1.11%。其主要香气成分为3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、十六酸乙酯、甲氧基苯基肟和2，3-丁二醇，相对含量分别为62.71%、6.61%、5.22%、4.02%和3.17%。

续表1 2种酵母发酵的杨梅果酒主要香气成分Continue table 1 Aroma components in waxberry wines fermented with two yeasts

2.4 两种酵母发酵的杨梅果酒中主要呈香物质分类比较

两种杨梅果酒中香气成分类型及相对含量见图5。

图5 两种酵母发酵的杨梅果酒香气成分类型及相对含量Fig.5 Chemical classes and contents of aroma components in waxberry wine fermented with two yeasts

杨梅果酒中香气成分按化合物结构分为醇类，酸类，酯类，醛、酮类，烷烃，烯烃类，酚、醚类和其他类，各类香气物质的相对含量由图5可知，杨梅果酒香气成分中主要以醇类和酯类为主（占80%多）且与以往研究结果类似，说明了在杨梅果酒的酿制中醇类物质和酯类物质是主要的挥发性风味化合物。两种杨梅果酒中，酯类和酸类物质的相对含量差别较明显，尤其是酵母71B发酵的杨梅果酒中酯类物质的相对含量相比酵母D254发酵的杨梅果酒高5.88%，这是因为果酒的成分极其丰富，发酵原料、酵母菌种以及发酵工艺操作和发酵条件等各项因素均会影响成品果酒的香气成分组成[23]。而醇类、醛酮类、烷烯类、醚类以及其他类物质的相对含量差异较小。

2.4.1 醇类香气物质比较

由图5可知，醇类物质是果酒中主要的呈香物质。高级醇的总量与3-甲基-1-丁醇的浓度密切相关，3-甲基-1-丁醇的浓度高于每种形式的总醇的60%以上[24]。由表1可知，两种杨梅果酒中共检测出3种醇类物质，相同醇类有2种，其中由酵母D254酿制的杨梅果酒中含量较高的只有3-甲基-1-丁醇，而酵母71B酿制的杨梅果酒中含量较高的醇类组分是3-甲基-1-丁醇和苯乙醇，3-甲基-1-丁醇是含量最多的高级醇类物质，是杨梅果酒重要的特征风味化合物。酵母71B酿制的果酒中含有的苯乙醇具有玫瑰花香[25]且从图5可以看出，酵母71B发酵的杨梅果酒中醇类物质的含量最高，这就说明酵母71B总体产醇能力要优于酵母D254。

2.4.2 酸类香气物质比较

由表1可知，酵母D254和酵母71B发酵的杨梅果酒中均检测出2种酸类分别是乙酸和辛酸，相对含量分别为7.96%，2.87%和1.06%，1.18%。两种酵母酿制的杨梅果酒酸类物质含量相比较明显，如酵母D254酿制的果酒中乙酸的相对含量达到7.96%。

2.4.3 酯类香气物质比较

由图5可知，两种杨梅果酒中共检测出酯类物质15种，其中11种酯类物质是两种共有的。由表1可知，酵母71B发酵的杨梅果酒种酯类组分的相对含量最高达到16.22%，说明酵母71B总体产酯能力要优于酵母D254。相对含量较高的几种酯类物质如十六酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯和十八酸乙酯为两种果酒所共有，但相对含量差异较大，尤其是酵母71B发酵果酒中十六酸乙酯和癸酸乙酯的相对含量远高于酵母D254。酯类香气主要是酵母菌活动以及在漫长的陈酿过程中产生，大多数都具有明显的花香味，如十六酸乙酯呈微弱蜡香、果爵和奶油香气；癸酸乙酯具有葡萄的香气[26]；辛酸乙酯具有白兰地酒香味等。

2.4.4 醛、酮类香气物质比较

由表1可知只有酵母D254检测出醛、酮类物质2种，而71B未检测到，这可能是受菌株本身的限制，如在发酵过程中不能产生这种成分，也可能是受检测方法的限制。虽然果酒酿制中醛、酮类物质的存在会对果酒香气有一定的贡献，如癸醛存在于柑橘、柠檬、草莓等中，具有甜香、柑橘香、蜡香和花香，但其中D254含有少量的2，5-二（三甲硅氧基）苯甲醛对人体有害的成分，而酵母71B不含有对人体有害的成分。

2.4.5 其他类香气物质比较

两种酵母发酵的杨梅果酒中检测出3种烷烃、烯烃类物质，1种酚、醚类，3种其他类物质，其中两种果酒共有的烷烃、烯烃类物质只有一种石竹烯（见表1）。有对东魁等品种杨梅的特征香气成分的研究表明，石竹烯等半萜烯类成分是杨梅的主要芳香物质[27]，然而由发酵制备的杨梅果酒、果醋中石竹烯含量却很低[28]，本文的结果也是如此，含量较低可能是由于发酵前的加热灭菌、酵母代谢及发酵散逸造成[28]。由表1结果可知，71B杨梅果酒石竹烯含量最高为0.31%，即酵母71B发酵制备杨梅果酒中含有的石竹烯等半萜烯类成分的损失相对小。在酵母D254和酵母71B发酵的杨梅果酒中均检测出甲氧基苯基肟，且相对含量较高，相对含量分别达到4.29%和4.02%，说明甲氧基苯基肟为杨梅果酒中主要风味物质之一。

3 结论

本文对D254和71B这两种酵母菌进行发酵试验制备杨梅果酒。测定指标的变化趋势表明，71B酵母酿酒过程中，生长状况佳。采用GC-MS分析两种酵母发酵的杨梅果酒香气成分，两种酵母发酵的酒样中共检测出香气28种，其中在酵母D254发酵的杨梅果酒中共检测出香气成分22种，在酵母71B发酵的杨梅果酒中共检测出香气成分24种。结果表明，与酵母D254相比，酵母71B发酵的杨梅酒中含有苯乙醇、十六酸乙酯和癸酸乙酯等具有特殊香气物质且杨梅中主要芳香物质石竹烯等半萜烯类成分损失较小，香气浓郁，是非常适宜传统工艺下酿制杨梅果酒的酵母。以此可为杨梅的进一步深加工及酿酒工艺优化提供参考。