铁皮石斛花多糖提取工艺及体外抗氧化性研究

缪园欣，廖明星，孙爱红，李蓉，*

（1.荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000；2.湖北省荆门市畜牧兽医局，湖北荆门448000）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛属多年生草本植物，是我国传统的名贵中草药，素有“救命仙草”之称[1-2]。现代药理学研究发现铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、抗氧化、降血糖等功能，此外研究还发现其对心血管和免疫系统疾病具有显著的疗效[2-4]。化学成分分析发现铁皮石斛含有生物碱、水溶性多糖、黄酮等生物活性成分[5-8]。石斛属植物一直以茎为药，而花未被药用。近年来，随着铁皮石斛大规模的种植，铁皮石斛花产量急增，造成了极大的资源浪费[9]。为了充分利用铁皮石斛花资源，对铁皮石斛花进行化学成分分析，发现其含有较丰富多糖、浸出物及氨基酸等营养成分[10-11]。多糖是一类广泛存在于微生物、植物细胞壁和动物细胞膜中的复杂糖类物质，具有抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等药理作用[12-14]。本试验采用超声波-微波协同法对铁皮石斛花多糖的提取工艺进行优化，并对铁皮石斛花多糖的体外抗氧化性进行研究，为铁皮石斛花的开发及生物活性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

铁皮石斛花：湖北洲和生态农业发展有限公司；1，1-二苯基基苯肼（1，1-dipheny 1-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、乙醇：上海凌峰化学试剂有限公司；试验用水为离子交换水。

EG823LC5-NR型微波炉：佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司；TY-1901型分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；YJ1002型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司；TG16-WS型低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-100KDB型高功率数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

取铁皮石斛花于60℃烘箱中烘干，然后用万能粉碎机粉碎，经40目筛得石斛花粉末备用。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制

称取100 mg于105℃干燥至恒重的标准葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀备用。精密吸取葡萄糖贮备液10 mL于100 mL容量瓶，用水稀释至刻度，得0.1 mg/mL葡萄糖标准液。分别吸取葡萄糖标准液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL具塞刻度试管中，用蒸馏水补至1.0 mL，加入5%苯酚1 mL，摇匀，然后立即加入5 mL浓硫酸，摇匀静置5 min，于90℃水浴加热20 min，然后冰浴冷却5 min，于488 nm波长处测吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线[15-16]。

1.2.3 铁皮石斛花多糖的测定

精密称取1 g铁皮石斛花粉，按不同的料液比加入蒸馏水，超声波-微波协同提取一定时间。提取完成后去除滤渣、醇沉，将得到的沉淀重新溶于水，按1.2.2的方法（苯酚-硫酸法）操作测得多糖浓度，并依据下列公式计算得出多糖提取率：

式中：C为石斛花样品中多糖的浓度，mg/mL；V为样品溶液稀释液体积，mL；N为稀释倍数；m为样品质量，g。

1.2.4 铁皮石斛花多糖提取工艺优化试验

1.2.4.1 料液比对多糖提取率的影响

准确称取 1.000 g样品，分别按 1∶20、1∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）的料液比加入蒸馏水，超声处理35 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取结束后定容，测定吸光度，并计算石斛花多糖提取率。

1.2.4.2 微波时间对多糖提取率的影响

准确称取1.000 g样品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸馏水，超声处理35 min，再分别在350 W微波功率下提取 1、3、5、7、9 min。提取结束后定容，测定吸光度，并计算石斛花多糖提取率。

1.2.4.3 超声时间对多糖提取率的影响

准确称取1.000 g样品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸馏水，分别超声处理 15、25、35、45、55 min，再在350 W微波功率下提取5 min。提取结束后定容，测定吸光度，并计算石斛花多糖提取率。

1.2.4.4 微波功率对多糖提取率的影响

准确称取1.000 g样品，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸馏水，超声处理45 min，再分别在250、300、350、400、450 W微波功率下提取5 min。提取结束后定容，测定吸光度，并计算石斛花多糖提取率。

1.2.5 提取工艺优化正交试验设计

为了确定最佳提取条件，在单因素试验的基础上，以石斛花多糖提取率为试验指标，设计L9（34）正交试验，对料水比、微波时间、超声时间、微波功率4个因素在3个不同水平上进行优化试验，因素与水平见表1。

表1 多糖提取工艺条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polysaccharides extracting conditions optimization

1.2.6 铁皮石斛花多糖体外抗氧化活性测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定

取 2 mL 不 同浓 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的铁皮石斛花多糖溶液于试管中，分别加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，充分混匀后避光反应20 min，在517 nm处测定吸光度为Ai，VC做阳性对照；对照组以无水乙醇代替DPPH，测定吸光度Aj；空白组以蒸馏水代替多糖溶液，测定吸光度为A0[17]。

DPPH自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

1.2.6.2 羟基自由基清除能力测定

取 2 mL 不同 浓 度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL）的石斛花多糖溶液，加入 2.0 mL 6 mmol硫酸亚铁、2.0 mL 6 mmol/mL双氧水，混匀后静置10 min，各加入2.0 mL 6 mmol水杨酸，混匀后再静置30 min，于510 nm处测吸光度Ai。以蒸馏水代替水杨酸测吸光值Aj，空白对照以2.0 mL蒸馏水代替石斛花多糖溶液测定吸光度A0[18]。

羟基自由基清除率/%=[A0-Ai+Aj]/A0×100

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线及回归方程

以葡萄糖标准液浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

根据图1，求得回归方程A=8.941 4C-0.012 2。式中：C为葡萄糖含量，mg/mL；A为吸光度。相关系数R2为0.999 3，表明在该浓度范围内葡萄糖浓度与吸光度线性关系良好。

2.2 铁皮石斛花多糖提取单因素试验

2.2.1 料液比对铁皮石斛花多糖提取率的影响

料液比对铁皮石斛花多糖提取率的影响见图2。

图2 料液比对多糖提取率的影响Fig.2 Impact of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由图 2 可知，料液比在 1 ∶20（g/mL）～1 ∶40（g/mL）范围内，随着溶剂的增加，固液接触面积增加，多糖提取率提高；此后，继续增加溶剂，由于单位体积溶剂吸收的超声波、微波能量减少，温度升高变慢不利于提取溶出[19]，多糖提取率呈下降趋势。因此，铁皮石斛花多糖提取时的最佳料液比为1∶40（g/mL）。

2.2.2 微波时间对铁皮石斛花多糖提取率的影响

微波时间对铁皮石斛花多糖提取率的影响见图3。

图3 微波时间对多糖提取率的影响Fig.3 Impact of microwave time on the extraction rate of polysaccharides

由图3可知，微波时间在1 min～5 min范围内，随着微波时间的增加，铁皮石斛花多糖提取率呈增加趋势；当微波时间超过5 min时，由于长时间高温作用，部分多糖结构被破坏，多糖提取率降低。因此，微波时间选择5 min较为适宜，该条件下的铁皮石斛花多糖具有较高的提取率。

2.2.3 超声时间对多糖提取率的影响

超声时间对多糖提取率的影响见图4。

图4 超声时间对多糖提取率的影响Fig.4 Impact of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由图4可知，超声时间在15 min～45 min范围内，铁皮石斛花多糖提取率随超声时间的延长而增加；当超声时间超过45 min时，由于长时间的空化作用和机械振动作用破坏了部分多糖结构，多糖提取率下降。因此，铁皮石斛花多糖提取的最佳超声时间为45 min。

2.2.4 微波功率对多糖提取率的影响

微波功率对多糖提取率的影响见图5。

由图5可知，微波功率在250 W～400 W范围内，随着微波功率的增加，物质吸收微波能越多，有效成分浸出约多，铁皮石斛花多糖提取率逐渐增加；此后，继续升高微波功率，部分多糖在高功率作用下分解，多糖提取率下降。因此，选择微波功率400 W为最佳微波功率。

图5 微波功率对多糖提取率的影响Fig.5 Impact of microwave power on the extraction rate of polysaccharides

2.3 提取工艺优化正交试验

为确定最佳提取条件，在单因素的基础上，研究超声时间、料液比、微波时间、微波功率对铁皮石斛花多糖提取的影响，以石斛花多糖提取率为评价指标，进行L9（34）正交试验。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 提取工艺条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

通过表3中提取率的极差分析结果可知，影响提取率的各因素主次顺序为超声时间＞料液比＞微波功率＞微波时间。试验指标提取率越大越好，从k值得出使石斛花多糖提取最佳的工艺条件为A3B3C1D3，即超声时间为 55 min，料液比为 1 ∶50（g/mL），微波时间为3 min，微波功率为450 W，在此条件下石斛花多糖提取率最高，为7.22%。由表3方差分析结果可知，因素A、B、D对石斛花多糖提取率有极显著影响（P＜0.01），因素C对石斛花多糖提取率无显著影响（P＞0.05），对多糖提取率影响的主次顺序为A＞B＞D＞C，即超声时间＞料液比＞微波功率＞微波时间，与直观分析结果一致。

2.4 铁皮石斛花多糖体外抗氧化活性测定

2.4.1 清除DPPH自由基能力的测定

清除DPPH自由基能力的测定结果见图6。

图6 石斛花多糖对DPPH自由基清除率曲线Fig.6 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale DPPH radicals

在最优的超声波-微波提取工艺下提取石斛花多糖，并对多糖进行清除DPPH自由基的活性测定，由图6可知石斛花多糖对DPPH自由基的清除率呈现浓度依赖性，随着多糖浓度的增加，清除率增加。

2.4.2 清除羟自由基能力的测定

清除羟自由基能力的测定结果见图7。

图7 石斛花多糖对羟自由基清除率曲线Fig.7 Scavening curves of the polysaccharides from flowers of Dendrobium officinale OH radicals

由图7可知，石斛花多糖对羟自由基的清除率具有浓度依赖性，清除率随浓度的增加而增加。

3 结论

本研究探讨了铁皮石斛花多糖的提取工艺，结果表明，各因素影响铁皮石斛花多糖提取率的主次顺序为：超声时间＞料液比＞微波功率＞微波时间。通过单因素试验及正交试验确定超声波-微波协同提取铁皮石斛花多糖的最佳工艺条件为：超声时间为55 min，料液比为1∶50（g/mL），微波时间为3 min，微波功率为450 W，在此条件下铁皮石斛花多糖提取率为7.22%。对超声波-微波协同提取的铁皮石斛花多糖进行活性研究，发现铁皮石斛花多糖有较好的抗氧化活性。这为铁皮石斛花的深入研究及开发利用提供了一定的理论参考。