HPLC法测定患者血浆中利奈唑胺的药物浓度

钱 钊，董增祥，郭美华，鲁 静，刘 亮，高春璐，茆俊东，海 鑫（哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，黑龙江 哈尔滨 150001）

1 仪器与试药

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；5430R高速低温离心机（德国Eppendorf公司）；MS3DS25涡旋混合器（德国IKA公司）；KQ-600数控超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）。

利奈唑胺对照品（上海麦克林生化科技有限公司，批号201424，纯度99%），奥卡西平对照品（中国食品药品检定研究院，批号201105，纯度99.7%），甲醇（Thermo Fisher Scientific公司，批号145176，色谱纯），水为超纯水（实验室自制），其他试剂均为分析纯。

收集2016年12月- 2017年4月在我院就诊并使用利奈唑胺抗感染治疗的门诊及住院部患者血样，共计7例。血液样本的采集时间是在患者连续用药5次，达稳态后给药前30 min内采集静脉血2 mL（EDTA抗凝），样品收集后，分离血浆且注明信息于- 20 ℃下保存。空白血浆由志愿者提供。所有血浆样品均经我院伦理委员会审定并批准使用。

2 方法与结果

2.1 HPLC法

2.1.1 色谱条件色谱柱：依利特Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（40∶60，v∶v）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：20 μL；柱温：35 ℃。

2.1.2 标准对照品溶液和内标溶液的制备精密称取利奈唑胺对照品49.93 mg，用适量甲醇配制成浓度为1980 mg·L-1的储备液；取适量储备液，用甲醇依次稀释配制成500、200、100、50、25、10、5 mg·L-1的7个浓度对照品溶液，同时配制高、中、低三个质控样品溶液（quality control，QC），浓度依次为400、200、20 mg·L-1，以上溶液均密封避光保存在4 ℃冰箱中。

精密称取7.42 mg的奥卡西平对照品（oxcarbazepine，OXD）作为内标（internal standard，IS），用适量甲醇配制成740 mg·L-1的储备液。取适量的奥卡西平标准溶液配制成200 mg·L-1的内标溶液，密封避光保存在4 ℃冰箱中。

2.1.3 血浆样品预处理精密吸取180 μL空白血浆和20 μL利奈唑胺对照品溶液，置于1.5 mL离心管中，加入20 μL内标溶液，涡旋30 s，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋1 min，离心5 min，取上层清液，过0.22 μm滤膜后，待分析。

2.2 方法学验证

2.2.1 专属性配制五组血浆样品，分别为空白血浆200 μL + 甲醇20 μL、空白血浆180 μL +LZD 20 μL + 甲醇20 μL、空白血浆200 μL + IS 20 μL、空白血浆180 μL +LZD 20 μL + IS 20 μL、患者血浆200 μL + IS 20 μL，按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录色谱图。从图1可以看出，LZD的保留时间为7.83 min，IS的保留时间为15.66 min，二者的峰形、分离度均良好，无干扰峰。

2.2.2 标准曲线取5、10、25、50、100、200、500 mg·L-1的利奈唑胺对照品溶液，按“2.1.3”项下方法进行处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰面积。以LZD浓度值为横坐标X，以LZD与IS峰面积比值为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y =9.97×10-2X + 2.24×10-2（r2= 0.999，n = 7），线性范围是0.5 ～ 50.0 mg·L-1。

2.2.3 回收率1）方法回收率：取高、中、低三个浓度的QC（n = 5），按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰面积，根据线性回归方程得出实际值；方法回收率为：实际值/理论值×100%。2）提取回收率：取高、中、低三个浓度的QC（n = 5），按照“2.1.3”项下方法处理，取上清液500 μL，加入40 μL甲醇，混合后进样分析，得到LZD与IS的峰面积比值，记为S1；取180 μL空白血浆，加入640 μL甲醇，混匀离心后取上清液500 μL，再加入20 μL QC和20 μL IS（n = 5），混匀后进样分析，得到LZD与IS的峰面积比值，记为S2；提取回收率为：S1/S2×100%。

在高、中、低三个浓度中，LZD的方法回收率在91.69% ～ 115.39%之间，提取回收率在81.50% ～117.31%之间。

图1 高效液相色谱图A - 空白血浆，B - 空白血浆 + LZD，C - 空白血浆 + 内标，D - 空白血浆 + LZD +内标，E - 患者血浆 + 内标；1 - LZD，2 - 内标（OXD）Fig 1 HPLC chromatogramsA - blank plasma, B - blank plasma + LZD, C - blank plasma + IS, D -blank plasma + LZD + IS, E - patient's plasma + IS; 1 - LZD, 2 - IS(OXD)

2.2.4 精密度1）日内精密度：在一天内，取高、中、低三个浓度的QC（n = 5），按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，计算日内RSD。2）日间精密度：连续5 d，取高、中、低三个浓度的QC（n = 5），按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，计算日间RSD。结果见表1。

2.2.5 稳定性实验取高、中、低三个浓度的QC（n= 10）20 μL，每份均加入180 μL空白血浆，涡旋混匀后密封保存在 - 20 ℃冰箱中。长期稳定性：60 d后取出5份，按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，计算长期稳定性的RSD。冻融稳定性：一周后取出5份，室温融化，反复冻融3次，按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，计算冻融稳定性RSD。室温稳定性：取高、中、低三个浓度的QC（n = 5），按照“2.1.3”项下方法处理，在室温下放置12 h后进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，计算室温稳定性RSD。

表1 利奈唑胺在患者血浆中的日内、日间精密度. n = 5Tab 1 Intraday, interday precision of LZD in human plasma. n = 5

在 - 20℃条件下保存60 d，反复冻融3次后，其稳定性良好，均符合稳定性要求；具体结果如表2所示。

表2 利奈唑胺在患者血浆中的稳定性. n = 5Tab 2 The stability of LZD in human plasma. n = 5

2.2.6 患者利奈唑胺血药浓度的测定取临床患者血浆样本，按照“2.1.3”项下方法处理，进样分析，记录LZD和IS色谱峰和峰面积，根据线性回归方程得出患者血浆中的利奈唑胺浓度。检测收集的7例患者的血浆样本，其中有5例患者的血浆药物浓度在2 ～ 7 mg·L-1范围内，有2例小于2 mg·L-1，可结合临床症状评价治疗效果，个体化调整药物剂量。

3 讨论

3.1 测定方法与线性范围的确定

目前，临床用于治疗药物监测的检测方法[5]主要有免疫法[6]、HPLC法[7-8]、HPLC-MS/MS[9]等。免疫法需要使用昂贵的试剂盒，且国内尚无用于LZD检测的试剂盒；HPLC-MS/MS因其设备昂贵，并非广泛普及的仪器；而HPLC作为一个常规的药物分析仪器，价格低廉，且易于操作，普及性较广；故本研究建立了LZD的HPLC检测方法。有研究表明利奈唑胺的有效浓度为2 ～ 7 mg·L-1[10-11]，本方法建立的线性范围为0.5 ～ 50.0 mg·L-1，可以满足日常LZD药物浓度检测。

3.2 流动相及前处理方法的选择

本研究选择的流动相为最常见、最简单的甲醇-水，成本低廉，且不需要繁琐的操作过程（如各种缓冲盐）[7,12]；实验过程中考察了流动相比例对LZD和内标保留时间和分离的影响，最终确定甲醇与水的比例为40∶60，在此条件下分离较好且没有内源性物质的干扰，二者在20 min内完成出峰。本研究前处理方法采用常规蛋白沉淀法，沉淀剂为流动相中的有机相，较张伦等[13]的前处理方法操作更简单、易于记忆，且提取回收率、峰形均满足要求。

3.3 内标的选择

本研究采用的HPLC法为内标法，较外标法的定量更为准确；内标物质选择奥卡西平，是新型的抗癫痫药，同为本实验室治疗药物监测的项目，标准品易于获得，且奥卡西平在254 nm处有最大吸收。

3.4 TDM的临床应用

自利奈唑胺在我国上市以来，临床应用中多为经验给药，均按说明书推荐的600 mg，bid的给药方案，从疗效评价的角度，多数患者并未达到最佳的治疗效果[14]；因此，需要对利奈唑胺进行治疗药物监测。本方法的临床应用中共检测了7例患者的血样，其中有5例患者的血药浓度在有效范围内，5例中有2例低于3.5 mg·L-1，另外2例低于LZD有效范围，提示药物浓度偏低，可结合临床症状进行药物剂量的调整。

综上所述，本研究建立的HPLC法简单、快速、准确、易操作，便于临床检验；为临床对利奈唑胺的TDM提供了方法学基础，为剂量调整提供参考，为最终实现个体化治疗方案及合理用药提供强有力的依据。