产志贺毒素大肠杆菌检测技术研究进展

杨 斌 ，邹 杰 ，羊 扬 ，朱国强

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC)是一种重要的人畜共患病病原菌，可以引起人类水样腹泻、出血性肠炎等轻度肠不适，严重时导致溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome，HUS)、终末期肾病(End stage renal disease，ESRD)甚至死亡。有研究显示，每年全球范围内估计感染致病型STEC造成超过2 800 000例人类急性疾病，死亡230例[1]。鉴于STEC对全球公共安全的重要影响，对其高效检测和鉴定至关重要。目前，许多微生物学实验室仅使用山梨醇琼脂培养基筛选STEC，这可能会造成非O157血清型的漏检，导致STEC感染报告疫情低于实际情况。鉴于目前使用的常规方法存在检测盲区，STEC感染的临床意义和经济损失促进了各种检测方法的发展，这些方法包括传统方法、免疫学检测技术和分子生物学技术等。本文将就STEC检测技术的最近研究进展进行综述。

1 传统方法

近年来，虽然科学家们开发了很多STEC的非培养检测方法，但细菌培养技术检测成本较低，且能够在有限的条件下较快速检出结果，由于其在细菌分离和分型中发挥重要作用，细菌分离培养这一传统方法仍然是不可或缺的金标准检测技术[2]。

当O157∶H7型大肠杆菌首次被确定为出血性肠炎的病原菌时，因其不能发酵山梨醇[3-4]，研究者将山梨醇代替一般麦康凯培养基中的乳糖开发了山梨醇麦康凯(Sorbitol-Mac Conkey，SMAC)培养基用于 O157∶H7型大肠杆菌的鉴定[4]。因一些非O157型STEC、变形杆菌等革兰阴性菌也不发酵山梨醇，为了更准确地筛选，研究者们又在SMAC中添加了抗生素如头孢克肟和特定的无机盐如亚碲酸盐[5]。SMAC是目前最常用的检测O157∶H7型的STEC培养基，虽然其检测O157型STEC显示出较好的敏感性、特异性及阴性预测值，但其缺陷在于无法检测非O157型STEC或者山梨醇发酵阳性的O157型STEC分离菌株，且检测假阳性结果较多[6-7]。

目前，在人类临床、兽医检测和食品检验等领域有许多检测STEC的商业化琼脂培养基，这些常见的琼脂培养基各具优缺点。第一个典型的选择培养基是法国科马嘉公司开发的仅能够检测O157型STEC的CHROMagar O157显色培养基[8]：使用头孢克肟-亚碲酸盐以及头孢磺啶进行选择，通过显色指示剂的作用，O157型STEC产生粉红色或淡紫色的菌落，而其它大肠杆菌形成蓝色菌落。与SMAC相比，其对O157型STEC的检测敏感度(98%)和特异性(77%)均优于SMAC[8]，且假阳性比例显著降低[9]。Rainbow O157培养基可以根据检测目标选择添加头孢克肟、亚碲酸盐和新生霉素中的一种或几种进行筛选，通过β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶与特殊的显色底物显色鉴别 O157型和部分非 O157型 STEC(如：O157∶H7、O26∶H11、O48∶H21、O111∶H-和 O111∶H8 血清型)。

近年来，科学家们开发了一系列旨在检测所有STEC血清型的培养基，其中最具代表性的就是CHROMagar STEC培养基。它基于特殊的显色底物使得STEC菌株出现淡紫色[10-12]。Gouali等针对329份临床标本的研究显示，采用CHROMagar STEC测试所有STEC样本，敏感性为91%，特异性为84%[13]。Hirvonen等的研究也有类似结果，针对264个样本中检测O157型STEC的敏感性为85%，O26型STEC的敏感性为90.0%，O111型STEC的敏感性为100.0%，O121型STEC的敏感性为100.0%，O145型STEC的敏感性为100.0%，检测STEC的特异性为98%[10]。一项针对CHROMagar STEC培养基、Rainbow O157培养基、CHROMagar O157培养基和Colorex O157培养基检测性能的比较研究显示，CHROMagar O157培养基和Colorex O157培养基无法检出大多数非O157分离株；而CHROMagar STEC培养基对含有非O157型STEC分离菌株的粪便培养物表现出优异的检出率(72%)，而Rainbow O157培养基对该型STEC检出率仅为26%[2]，这与以前的研究结果基本一致。该研究还表明CHROMagar STEC培养基具有极高的阴性预测值(99.6%)，因而在排除STEC感染方面表现出前所未有的优势。

目前的培养方法均存在一定比例的假阴性和/或假阳性结果，建议在实际应用中补充使用其它非培养方法。此外，培养方法还存在操作较为复杂、耗时较久、检测敏感性较低等缺点。

2 免疫学检测技术

由于没有一种培养方法能够检测所有血清型的STEC，研究者们也尝试使用免疫学方法鉴定O、H抗原或者志贺毒素以检测STEC。凝集试验通过观察菌株与抗血清的特异性凝集来判断其血清型，这种方法快速、简便，但误差较大。

ELISA检测法具有特异性强、灵敏性高和易于操作等特点，已经在各种病原微生物的抗体监测中广泛应用。宋璐等建立了用于检测STEC志贺毒素Stx1的双抗体夹心ELISA，能够检测重组Stx1、天然Stx1，且与Stx2无交叉反应，显示了良好的特异性，但灵敏度尚需进一步完善[14]；张雪寒等选择eae编码的紧密素为检测靶标建立了STEC ELISA技术，30 ng/m L的抗原包被浓度便能检出血清中的抗体[15]；Narasimha等通过靶向STEC的O抗原LPS中高度保守的脂质A部分建立了夹心ELISA方法，用该方法检测6种主要的非O157型STEC(O26、O45、O103、O111和O121血清型)，检测敏感性和特异性均较为出色(特异性为98.2%～100%，敏感性为5×105cfu/m L)[5]。

免疫层析技术是一种结合了免疫技术和色谱层析技术的检测方法，其在STEC检测中可以区分Stx1和Stx2，目前应用较多的是商业化胶体金免疫试剂盒，有Duopath Vero毒素检测法和Immuno Card STAT!检测法。两项研究表明，Duopath Vero毒素检测法无论是液体培养基样品还是固体培养基样品，其检测敏感性均很高[16-17]。当分别检测Stx1和Stx2时，检测Stx2的灵敏度更高，但与检测Stx1相比，特异性较低。即使预先用液体选择培养基增菌，Immuno Card STAT检测STEC的敏感性也仅为35.5%[18]，但其检测特异性大于99%[19]。

目前，国际上应用比较广泛的有Premier肠出血性大肠杆菌微孔板免疫测定法和ProSpect STEC检测法。有两项研究显示，不论是直接检测还是过夜培养，两种方法均有较高的灵敏度，且均超过95%[16,20]，另有两项研究表明其有较高的特异性，但是敏感性并不如PCR方法[21-22]。Gerritzen等对ProSpectSTEC检测法、微孔板免疫测定法进行了临床评估，发现前者的敏感性不如后者[23]。

虽然目前在很多研究中使用免疫学技术检测STEC，但是如果单独依赖该检测技术，对结果必须要谨慎。美国曾有两例通过酶免疫技术检测STEC出现阳性结果，实际却是诺瓦克病毒的报道[2]。

3 分子生物学技术

通过靶向STEC特异性基因片段，采用分子生物学技术检测临床样品中的STEC菌株也引起了科学家们的兴趣。该技术最早可以追溯到使用志贺毒素基因stx1和stx2的克隆部分作为35S标记的DNA探针，利用菌落杂交测定技术检测STEC。在DNA杂交检测技术发明后不久，科学家们设计了在单一反应(体系)中靶向stx1和stx2的传统PCR方法。后来随着技术的不断发展，科学家建立了许多靶向不同目的基因组合的PCR检测方法，如PATON等建立了扩增stx1、stx2、eae、ehx A和saa基因的多重PCR方法，结果显示所有待测STEC菌株均有这5种致病基因的几种或全部，通过该方法能够检出所有待检STEC[24]。

目前已经开发了许多PCR检测法，其中使用较多的有荧光定量PCR技术。荧光定量PCR方法的优点有优异的灵敏度和特异性，可以快速筛选STEC的靶基因(如stx1、stx2和eae等基因)。除此之外，一些PCR方法还靶向O157型STEC和非O157主要的6种血清型STEC的特异基因，如Li等建立了靶向Z3276和志贺毒素基因(stx1和stx2)的多重荧光定量PCR技术，不仅检测O157型STEC时敏感性达到100%，而且能够以100%特异性筛选出所有非O157型STEC，检测限为40 cfu/反应[25]。

目前还有许多用于多种胃肠道病原体的多重分子检测方法。如采用多重PCR技术原理设计的xTag肠道病原体检测平板(Gastrointestinal pathogen panel，GPP)：通过逆转录步骤扩增多种肠道病原体核酸，将产生的扩增子杂交到与中心体结合的寡核苷酸后由仪器检测。xTagGPP中包含检测大肠杆菌多种血清型STEC的独立靶标，在检测中表现出较高灵敏度和特异性。Deng等利用xTagGPP检测290份粪便样品中的STEC，敏感性和特异性分别为96.3%(93.3%～98.2%)和99.8%(99.6%～99.9%)[26]。另有报道应用xTagGPP从细菌培养或常规PCR方法检测结果为阴性的样品中检测出STEC[27]。

环介导等温扩增技术(LAMP)是通过针对靶基因6个特定区间设计4对特殊引物，利用高活性的链置换DNA聚合酶，在60℃～65℃恒温扩增DNA的新技术，反应能够产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在，无需荧光检测，还具有灵敏度和特异性高、省时、成本低廉等优点[28]。最近，一些研究者开发了靶向O抗原特异性基因(rfb E、wzx和wzy等)用于检测O157∶H7血清型的LAMP技术[29-32]，例如Zhu等靶向stx2、rfb E和fli C基因和Jiang等靶向rfb E基因开发的 LAMP技术[32]，两种检测 O157∶H7型STEC的LAMP技术每个反应检出限分别为26 cfu和10 cfu。Hadi等开发了一种靶向z3276片段的LAMP技术，阳性预测值为100%，检出限为每个反应5 cfu，优于其它几种LAMP技术[33]。LAMP的缺陷在于无法开发多重检测，因而只能检测鉴定某一带有特定分子标记的血清型STEC。

鉴于STEC菌株血清型众多，因而对STEC血清型分型的分辨率要求也越来越高。目前使用STEC指纹图谱技术，如脉冲场凝胶电泳技术(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)或使用细菌分子分型国家电子网络(PulseNet)协议进行多位点可变数串联重复序列分型分析(Multi-locus variable number tandem repeat analysis，MLVA)，可以比较来自不同国家的菌株，并有助于在全世界范围内，尤其是目前感染正在扩散的地区进行STEC流行病学追踪[34]。PFGE和MLVA等方法在目前的疫情调查中发挥了至关重要的作用，另外全基因组测序(WGS)也成为细菌分型的有效方法。WGS技术的分型分辨率相比现有的方法提升了几个数量级。然而，随着STEC分型技术的提高，血清型数据的采集技术、标准化处理和信息管理等环节均需要进一步的提升和完善。

4 小结与展望

上述提到的所有检测技术均是优点和缺点并存：传统培养技术的灵敏度和阳性预测值均普遍较低，但可以在菌株分离之后通过其它方法进一步分型；免疫学技术可能出现假阳性并且检测成本较高，但可以用于致病毒素和非O157型STEC的检测。分子生物学技术缺点是费力且昂贵，但对所有STEC血清型均有较高的灵敏度和特异性。因而建议在实际应用时，将培养方法和非培养方法组合使用，形成一套检测程序，可以有效提高检测能力[35]。在检测程序中，为了以较低的成本筛选出流行性较低的病原菌，可以先使用非培养方法对收集到的临床样品初筛，一旦获得阳性结果，即可在显色培养基上选择培养以获得分离菌株，进而再对菌株进行血清学分型。然而，由于STEC的检测标志物与致病性缺乏直接联系，这给检测STEC致病性菌株带来了一定的困难。此外，由于致病性STEC缺少绝对特异的检测标志物，因此设计的检测程序需要一定的包容性以避免漏检新出现血清型的菌株。为了鉴定引起人类严重疾病的STEC菌株，欧洲食品安全局(EFSA)提出在检测程序中添加检测stx以外的基因，如与肠道黏附作用有关的aai C和agg R基因，它们与stx和eae基因一样均与STEC强致病力有关[36]。

如上所述，很多实验室对于STEC的检测技术做了很多重要探索，开发了一些在STEC鉴定方面有很好应用前景的新方法，但是考虑到一些新方法的使用限制、检测成本和检测结果的可靠性，至少在目前STEC的检测很可能将继续依赖结合培养方法和非培养方法形成的一套检测程序。无论如何，只有对STEC鉴定方法和检测程序的持续优化，才能有效监测STEC的流行情况，进而对该病原菌进行有效地防控。