不同方法诱导的γδT细胞体外抗肺癌作用比较

赵鑫 常颖 刘玉侠 王宝 卢卫平 王启文

(1吉林省肿瘤医院 ，吉林 长春 130012；2吉林省肿瘤防治研究所)

肺癌在我国已经成为常见的恶性肿瘤，近年来发病率居高不下，其常规治疗方法有手术、化疗、放疗等，但治疗后有许多病人会出现转移和复发，其原因与化疗、放疗后机体的免疫功能下降有关。针对这一现状，对放化疗后患者提高免疫力进行预防肿瘤转移和复发就显得尤为重要。如何提高免疫力，预防肿瘤转移和复发，目前的研究已经证明树突细胞(DCs)、细胞因子活化的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NKs)、γδT细胞等免疫细胞对提高机体的免疫功能发挥着重要作用。而近年来的研究证实，γδT细胞在抗肿瘤免疫反应中发挥着独特的作用。众所周知，体内起主要作用的抗肿瘤细胞是T淋巴细胞。T细胞根据表面抗原受体(TCR)的不同分为αβT细胞及γδT细胞。在机体内，αβT细胞主要通过主要组织相溶性抗原(MHC)限制性识别肿瘤细胞，参与获得性免疫，使其应用受限。而γδT细胞是一种介于获得性免疫与天然免疫之间的细胞，其功能不受MHC限制，不依赖于抗原的处理和递呈过程，所以近年来对其研究较多。本实验通过用抗人TCR γ/δ联合白细胞介素(IL)-2及唑来膦酸联合IL-2两种方法进行γδT的体外诱导扩增，并对肺癌细胞A549进行体外杀伤实验，为γδT细胞的研究和用于肺癌的治疗提供实验数据。

1 材料和方法

1.1材料 IMDM细胞培养基：美国Gibco公司， 噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司，胎牛血清：Hyclone公司；IL-2：北京远策药业有限责任公司；淋巴细胞分离液：中国医学科学院生物工程医学研究所；唑来膦酸：深圳海王药业有限公司；抗人TCRγ/δ，PE标记的抗人TCRγ/δ克隆B1:Biolegend公司。 生物倒置显微镜(Olympus)：日本；低温低速离心机(SORVALL RTT)：美国；全自动酶标仪：Labsystems Dragon；超净工作台：苏州净化设备厂；HERA CEEL 240iCO2培养箱，Thermo Scientific公司；流式细胞仪，BD公司。肺癌细胞A549：购于上海生物细胞研究所。

1.2方法

1.2.1人外周血γδT细胞的体外诱导、培养、鉴定 抽取健康志愿者外周血，用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，计细胞数为1×106/ml,加至100 ml细胞培养瓶，放入37℃，5%CO2培养箱中饱和湿度下培养。诱导方法1：取1瓶以上分离的细胞，加入抗人TCRγ/δ 0.4 μg/ml,IL-2 300 IU/ml,放入37℃，5%CO2培养箱中，每3天半量补加抗人TCRγ/δ、IL-2等细胞因子并换液，培养至第6天时，用流式细胞仪对培养的细胞进行γ/δT细胞表型鉴定及杀伤活性实验。诱导方法2：另取1瓶分离的细胞，加入唑来膦酸10 μmol/L,IL-2 500 IU/ml,培养方法同1。取以上抗人TCRγ/δ加IL-2及唑来膦酸加IL-2的细胞进行γ/δT细胞表型鉴定。方法：分别取以上培养的细胞，调细胞数为(5～10)×105/100 μl ，加PE抗人TCRγ/δ 20 μl，冰上孵育15 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，最后加PBS 500 μl，混匀，上流式细胞仪进行检测。

1.2.2γδT杀伤实验(MTT法) 接种肿瘤细胞。将培养至对数生长期的A549细胞接种到96孔细胞培养板，100 μl/孔。将经过两种方法培养鉴定的γδT细胞调细胞数为2.5×106/ml,按以下设计加入到已经接种了A549的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，每个样品设6复孔。第1组：抗人TCRγ/δ +IL-2，第2组：抗人TCRγ/δ +IL-2+A 549，第3组：唑来膦酸+IL-2，第4组：唑来膦酸+IL-2+A549，第5组：A549。以上细胞培养48 h，培养结束前4 h加MTT(5 mg/ml) 20 μl/孔，培养结束后，小心吸去上清，每孔加150 μl DMSO，震荡混匀，在酶标仪492 nm波长处测OD值。杀伤活性计算方法：杀伤活性=(1-实验组OD值-效应细胞OD值)×100%/靶细胞OD值×100%。

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

抗人TCRγ/δ联合IL-2诱导的γδT细胞表达率为62.10%，对A549的杀伤活性为82.47%；唑来膦酸联合IL-2诱导的γδT细胞表达率达61.50%，对A549的杀伤活性为81.09%，两组细胞表达率及对A549的杀伤活性差异均无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨 论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位均居恶性肿瘤之首。虽然肺癌早期通过手术治疗可以取得较好的治疗效果，甚至部分患者通过手术切除后可以达到治愈。但是因为肺癌初期无明显症状，发现时大多已处于晚期，使其治疗效果和预后较差。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌病例总数的80%〔1〕，NSCLC根据病理类型可分为肺鳞癌、肺腺癌和大细胞肺癌等，其中肺腺癌占NSCLC的大多数。对于晚期患者，多数已不适合手术，只能采取化疗、放疗等方法治疗，或者是手术后需要进行化疗、放疗等后续治疗，但是这些治疗会使患者的免疫功能遭受打击，使免疫功能明显下降，导致治疗不能顺利进行，影响效果。

免疫治疗作为肿瘤治疗的方法之一，目前在肿瘤的治疗中发挥着一定作用。在免疫治疗过程中，免疫细胞可以直接参与杀伤肿瘤细胞及通过分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α等具有杀伤活性的细胞因子进行抗肿瘤反应，还可以通过激活机体免疫系统提高机体免疫力达到主动抗肿瘤的效果，因此在肿瘤的综合治疗中发挥着重要作用〔2〕。目前已有多种免疫细胞用于恶性肿瘤的治疗，在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用。

众所周知，T淋巴细胞是主要的抗肿瘤细胞。γδT细胞是近年来发现的一种功能强大的T淋巴细胞，在机体内具有杀伤和调节双重作用〔3〕，同时维护机体的免疫平衡，所以在肿瘤的综合治疗中发挥着非常重要作用，在抗感染等方面也发挥着重要作用〔4，5〕。在抗肿瘤过程中，γδT细胞能够以MHC非限制性地方形式特异性识别肿瘤抗原，作为抗原提呈细胞(APC)起到抗原递呈作用，特异性杀伤肿瘤细胞，并通过分泌IL-2、TNF-α、γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子促进其他免疫细胞的活化〔6〕，对肿瘤细胞直接杀伤。另外，γδT细胞还能与其他多种免疫细胞相互作用，激发这些细胞发挥抗肿瘤作用。体外实验证实，γδT细胞能杀伤多种自体肿瘤细胞或异基因来源的肿瘤细胞系，而不会影响正常细胞的功能〔7～9〕。但是由于γδT细胞在外周血中所占比例较少，只有1%～10%〔10〕，使其研究和应用得到限制。如何获得较多数量的γδT细胞，对其功能进行深入研究成为首要解决的问题〔11〕。

唑来膦酸是双磷酸盐类药物，临床上主要用于肿瘤患者如乳腺癌、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌等多种实体瘤化疗后引起的骨转移和高钙血症的治疗〔12〕。研究发现唑来膦酸还能活化人外周血γδT细胞〔13〕，它既能促进γδT细胞的生长，也能抑制肿瘤细胞生长〔14,15〕,而且与其他诱导γδT细胞的化学试剂相比，其价格要低很多。本实验根据其特性，用其联合IL-2培养诱导的γδT细胞与用γδT CR联合IL-2诱导的γδT细胞进行比较，两种诱导方法无论是在表达率还是杀伤活性方面没有明显差异，为γδT细胞的扩增及应用提供了经济实用的方法。