miRNA调控Wnt/β-catenin通路与糖尿病骨质疏松的中西医研究进展❋

陈 哲，李惠林，李增英，赵恒侠，周熠楠，帅优优

(1. 广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033； 2. 深圳市中医院，广东 深圳 518033)

糖尿病骨质疏松(diabetic osteoporosis，DOP)是指糖尿病并发的以骨质疏松为主要表现的一种代谢性骨病，属于糖尿病并发症中发病率较高的一种疾病。糖尿病骨质疏松的发病机制复杂，糖尿病可通过多种途径影响骨代谢，但有关糖尿病骨质疏松发病的分子机制仍有待明确。Wnt/β- catenin通路是成骨细胞分化和骨基质形成的关键途径，在促进成骨细胞分化过程中起着重要作用[1]。而成骨细胞形成、数量及其分化能力在糖尿病骨质疏松的发病过程中也密切相关，且miRNA可以调控Wnt信号通路关键因子的表达，对Wnt信号通路具有强大的调控作用[2]。现对miRNA调控Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病骨质疏松关系的中西医研究进展综述如下。

1 miRNA与Wnt/β-catenin信号通路

miRNA是一类广泛存在于真核生物染色体上的内源性非编码单链小分子RNA，主要通过与靶mRNA的3’端非编码区域特异性不完全碱基互补配对，降解靶mRNA或抑制其负性表达而发挥生物学作用[3]。由于miRNA可以结合多个靶标，有人提出它们可以调节基因组中高达30%的蛋白质编码基因，是重要的基因表达调控因子[4]。miRNA已成为当今世界的研究热点之一。而miRNA在调控Wnt信号通路中起关键作用，是Wnt信号通路调控的基础。

Wnt /β-catenin通路又称为经典的Wnt信号通路。在此信号通路中，Wnt蛋白通过与细胞跨膜特异性受体卷曲蛋白(frizzled，Frz) 及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (LDL-receptor-relatedprotein5/6，LRP5/6) 结合，活化细胞质内散乱蛋白(dishevelled，Dsh)，抑制β-catenin与轴蛋白(Axin)、结直肠腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)等形成降解复合物，使GSK-3β的底物β-catenin 免受降解而在胞内积聚，然后转入细胞核内启动下游靶基因转录，进而调控细胞增殖和分化[5]。Wnt /β-catenin 信号通路受GSK-3β、APC、Dsh、DKKs、Sclerostin、SFRPs等因子调控。其中DKKs是由2个富含半胱氨酸结构域组成的发育调控信号分子，其能够通过直接与LRP5/6结合抑制Wnt 蛋白与LRP5/6的结合，从而使Wnt 信号通路受到抑制[6]。骨硬化蛋白(Sclerostin)则是由硬化蛋白基因SOST编码、由骨细胞合成和分泌的一种糖蛋白，其抑制Wnt /β-catenin信号通路的作用也是通过与Wnt蛋白竞争结合LRP5/6受体[7]。而分泌型卷曲相关蛋白(SFRPs)则包含一个与Frizzled 蛋白结构相似的区域，可直接与Wnt 配体相结合，从而作为Wnt 信号通路的内源性拮抗剂抑制Wnt 信号通路[8]。

2 Wnt/β-catenin信号通路在骨重建过程中的调控作用

Wnt/β-catenin信号通路可直接影响骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的分化过程，在膜内成骨及软骨内成骨过程中，若β-catenin基因失活则间充质干细胞不是向成骨细胞方向转化，而是分化为软骨细胞[9]。Kobayashi等发现，在β-catenin基因敲除小鼠的膜内成骨和软骨内成骨的过程中，BMSCs向软骨细胞分化而非分化为成骨细胞[10]。体外敲除β-catenin基因的鼠颅盖骨细胞也进一步证实，Wnt通路会影响成骨细胞分化和骨形成。Mbalaviele G等研究即发现，缺失β-catenin基因的颅盖骨细胞在成骨培养下转向软骨细胞分化，而野生型的鼠颅盖骨细胞则向成熟的成骨细胞分化[11]。

Wnt/β-catenin通路除了具有可以促进成骨细胞分化的作用外，也可抑制破骨细胞分化。由成骨细胞表达的核受体KB激活受体配体(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)，与破骨细胞表面的受体RANK结合后，可促进破骨细胞的分化增殖，而同样由成骨细胞表达的骨保护素(osteprotegerin，OPG)，作为RANKL的假性受体，二者之间具有高度的亲和力，可以阻碍RANKL与RANK结合，从而抑制破骨细胞分化增殖，减少骨量丢失[12]。有研究指出，成骨细胞中β-catenin的失活将导致RANKL/OPG比值增加，使骨质减少，而APC的缺失则会使比值减小，骨量增加，故Wnt/β-catenin通路可通过下调RANKL、上调OPG使比值增大，间接调控骨吸收[13]。

3 miRNA调控Wnt/β-catenin信号通路在成骨分化中的作用

miRNA对Wnt/β-catenin通路具有强大的调控作用，可以调控该通路中多种关键因子的表达，在成骨分化过程中具有重要作用。Kapinas等研究发现，Wnt/β-catenin信号通路可以诱导miR-29a的表达，高表达的miR-29a可直接抑制该信号通路的负性调节因子DKK1、Kremen2、SFRP2，促进成骨分化信号的传递[14]。miR-218也是促进成骨细胞分化Wnt通路的强大的激活者。Hassan等研究发现，miR-218可通过下调Wnt信号通路的3种抑制剂Sclerostin、DKK2、SFRP2激活Wnt通路[15]。Zhang等研究发现，miR-335-5p可通过下调DKK1增强Wnt通路信号，从而促进GSK-3β磷酸化和β-catenin 转录表达，调节成骨分化[16]。Wang等研究发现，miR-27的表达水平与Wnt信号通路中关键蛋白质的β-catenin呈正相关，且验证了miR-27直接靶向抑制APC基因表达，使β-catenin积累从而激活Wnt信号传导，促进成骨细胞分化[17]。Guo等研究发现，SFRPs是miR-27a的靶标，在间充质前体细胞系(hFOB1.19)分化中，miR-27a可通过抑制SFRPs的表达，激活Wnt信号通路，从而促进成骨细胞增殖和分化[18]。Su等研究发现，miR-26a通过抑制靶基因GSK-3β实现对Wnt信号通路的调控，miR-26a 的过表达可以增加BMSCs中β-catenin表达，增强Wnt信号通路，促进BMSCs向成骨分化[19]。Chen等研究发现，SOST是miR-204的靶基因，miR-204的表达增加可以抑制SOST水平，这表明miR-204可以通过抑制SOST的表达激活Wnt信号通路，促进成骨分化[20]。

但也有研究显示，miRNA可对成骨分化进行负性调控。如miR-23a的过表达抑制体外hBMSCs的成骨分化，而miR-23a的下调则促进成骨分化，进一步研究证实LRP5是miR-23a的直接靶标，敲低LRP5抑制hBMSCs的成骨分化，与上调miR-23a中观察到的效果相似，表明miR-23a在hBMSCs的成骨分化中起抑制作用，其可能通过靶向LRP5而起作用[21]。Liang等通过检测miR-141和miR-22在成骨过程中的表达谱，发现二者均显著下调，通过用miRNA模拟转染hMSC，结果显示miR-141和miR-22均显著下调共同靶标β-Catenin的表达水平，而用miR-141和miR-22抑制剂转染细胞则显示，抑制剂对miR-141和miR-22的抑制作用使β-Catenin的表达水平上调。进一步研究证实，miR-141和miR-22显著减少成骨细胞分化过程中钙结节的形成，而且通过RT-PCR检测各种成骨相关标志物基因，显示miR-141和miR-22下调大部分成骨标志物基因，表明这2种miRNAs是成骨细胞分化的潜在负调节因子[22]。

4 Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病骨质疏松的现代医学研究

在糖尿病骨质疏松的发病过程中，Wnt/β-catenin信号通路异常已被得到证实。Portal-Nunez等通过测定STZ诱导糖尿病大鼠模型的骨密度及β-catenin蛋白表达量，证实糖尿病大鼠存在显著的骨量下降，骨形态发生改变，其成骨细胞及骨细胞中的β-catenin表达量也显著下降。将β-catenin下降程度与骨细胞减少程度进行对比，结果表明β-catenin的下降并非是骨细胞活性降低引起。此外该研究也发现，转移到细胞核的β-catenin数量显著减少，并伴随WIF-1、Wisp1和Wnt1等蛋白表达量的显著下降，证实糖尿病大鼠存在Wnt/β-catenin通路的失调，此通路失调与糖尿病骨质疏松发病有重要联系[23]。Hie等研究则发现，由STZ诱导的胰岛素依耐性糖尿病大鼠在胰岛素缺乏时SOST和Dkk1表达增加，导致Wnt通路被抑制，成骨分化减弱[24]。López-Herradón等通过研究STZ诱导的糖尿病小鼠，发现暴露于高糖下的MC3T3-E1细胞其LRP5和LRP6表达下降，但DKK1的表达显著增强，而DDK1可以抑制与Wnt3a刺激有关的TCF/LEF依赖性转录活性和β-catenin在细胞内的累积，证明与糖尿病相关的骨质减少症存在Wnt/β-catenin通路的下调[25]。Yee等研究发现，STZ诱导的糖尿病小鼠Sclerostin水平升高，β-catenin活性降低，与Sclerostin作为Wnt拮抗剂的功能一致，而SOST抗体(SostAb)的治疗则增强了β-catenin活性，促进成骨细胞分化和骨化矿化，在STZ诱导的T1DM骨折模型中挽救了受损的成骨[26]。

国内也有相关研究，如Jin等研究发现在STZ诱导的糖尿病大鼠中，其成骨细胞分化及抗凋亡能力明显受损[27]。Qian等通过研究高脂饮食/低剂量链脲霉素诱导的2型糖尿病大鼠，发现BMSCs的细胞代谢活性、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化和成骨基因表达均降低，反映Wnt信号的表达水平基因，如β-catenin、细胞周期蛋白D1和c-myc也显著降低，但GSK-3β的表达保持不变，2型糖尿病大鼠BMSCs的成骨潜能不受培养环境影响，但会因为Wnt信号通路的抑制而受损。这可能是由于β-catenin的积累不足而不是因为GSK-3β的刺激[28]。王燕研究也发现，2型糖尿病大鼠和去卵巢大鼠LRP5及β-catenin表达均明显减低，表明2型糖尿病去卵巢大鼠骨组织Wnt信号通路抑制是2型糖尿病和去卵巢共同作用的结果，而2型糖尿病去卵巢大鼠和去卵巢大鼠骨组织LRP5及β-catenin表达减少，同时Runx2表达明显减低，提示Wnt信号通路抑制可能下调基因影响成骨细胞分化和骨形成[29]。

5 基于Wnt/β-catenin信号通路防治骨质疏松的中医药研究

近年来，基于Wnt 信号通路运用中医药防治疾病的研究逐渐增多，已成为中医药领域的研究热点。而基于Wnt/β-catenin信号通路防治骨质疏松的中医药研究，也已取得了不少成果。陈云刚等用不同浓度骨碎补含药血清干预BMSCs，发现骨碎补含药血清能够促进BMSCs增殖，提高ALP活性，促进钙化结节的形成，其机制与骨碎补含药血清上调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、LRP5、Runx-2及Osteriex的表达及下调GSK-3β的表达密切相关[30]。涂艳等通过体外培养SD大鼠的BMSC，并给予淫羊藿苷干预后，发现ALP的活性增强，Wnt10b、GSK-3β、β-catenin、Runx2及LEF1表达水平上调，初步证明淫羊藿苷可以激活Wnt/β-catenin信号通路，参与并调控BMSC的成骨分化[31]。张哲等通过观察Wnt/β-catenin信号通路在老鹳草素诱导小鼠BMSCs增殖和成骨分化中的作用，发现老鹳草素各剂量组Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2和蛋白表达较对照组显著上调，GSK-3β和蛋白表达较对照组显著下调且呈剂量依赖性，证明老鹳草素能够明显促进BMSCs的增殖及向成骨方向分化，其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关[32]。许应星等研究发现，补肾活血颗粒含药血清能够显著上调β-catenin、LRP5和TCF的蛋白表达，增强成骨细胞的成骨活性和矿化能力，表明其治疗骨质疏松症的作用机制与Wnt/β-catenin信号通路密切相关[33]。何帮剑等通过观察益骨汤含药血清对SD大鼠成骨细胞的经典Wnt信号通路的影响，发现益骨汤可以抑制DKK1的高表达，从而上调Wnt/β-catenin通路中β-catenin、LRP-5、TCF的表达，达到促进成骨细胞增殖而起到抗骨质疏松作用[34]。而李玲慧等观察温肾阳、滋肾阴中药复方对大鼠成骨细胞影响的差异以及相关的分子生物学机制，发现右归丸可显著上调β-catenin表达，下调GSK-3β蛋白表达，且较左归丸更为显著，表明温肾阳复方右归丸可通过激活Wnt/β-catenin信号通路，提高成骨细胞分泌ALP的能力[35]。

6 基于Wnt/β-catenin信号通路防治糖尿病骨质疏松的中医药研究

随着基于Wnt通路防治骨质疏松的中医药研究的不断深入，中医药通过该通路防治糖尿病骨质疏松的研究也开始涌现。李翠娟等通过观察固本活血壮骨颗粒对糖尿病大鼠模型成骨细胞Wnt/β-catenin信号传导通路的影响，发现固本活血壮骨颗粒可提高糖尿病模型成骨细胞Wnt1、LRP-5以及β-catenin蛋白的表达，从而调节Wnt/β-catenin信号传导通路的失调状态，促进骨形成，减少骨吸收，起到防治糖尿病性骨质疏松症的作用[36]。许建国通过观察糖尿病性骨质疏松模型大鼠骨代谢相关血生化指标、骨密度及骨组织中Wnt及NF-κB信号通路中相关因子表达的变化以及补肾健脾活血汤的干预作用，发现补肾健脾活血汤可以提高DOP大鼠骨组织中Runx2、LRP5、β-catenin表达水平，降低TRAF6、NF-κB、NFATc1表达水平，表明补肾健脾活血汤可通过激活Wnt信号通路，抑制NF-κB通路相关因子表达，进而起到抗糖尿病性骨质疏松的作用[37]。本课题通过研究滋肾降糖丸对糖尿病大鼠Wnt/β-catenin信号通路的调控作用，发现糖尿病通过下调Wnt3α、LRP-5、β-catenin及Runx-2基因的表达，导致大鼠骨组织Wnt/β-catenin通路障碍，从而影响成骨细胞分化，而滋肾降糖丸能上调Wnt/β-catenin通路中上述重要基因的表达，促进成骨细胞分化，发挥防治糖尿病骨质疏松的作用[38]。

7 展望

糖尿病骨质疏松的发病机制复杂，影响因素较多，miRNA调控Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病骨质疏松发病过程中的作用机制尚未完全明确。中医药资源丰富，其多途径、多靶点的作用特点在防治疾病中具有较大优势和挖掘潜力。目前基于Wnt/β-catenin信号通路探讨中医药防治糖尿病骨质疏松的研究也日益增多，但中医药通过调控相关miRNA表达，进而介导Wnt/β-catenin信号通路以防治糖尿病骨质疏松的作用机制仍需进一步研究。本课题组目前正对miRNA通过下调Wnt/β-catenin通路介导糖尿病骨质疏松的作用机制及中医药的干预作用进行相关研究，相信随着研究的深入，miRNA调控Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病骨质疏松发生发展过程中的作用机制必将得到揭示，并通过研究中医药对此信号通路的干预作用，为今后探讨中医药防治糖尿病骨质疏松的作用机制提供新的思路和方法。