杆菌肽锌产品中挥发性杂质来源考察与研究

赵建强，韩静

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳 117004；2.华北制药华胜有限公司，河北石家庄 052160）

杆菌肽锌（Bacitracin Zinc）属于多肽类抗生素，是杆菌肽A、B1、B2、B3的锌盐混合。杆菌肽锌是由地衣芽孢杆菌经生物发酵获得的代谢物，经GC检测证实：杆菌肽锌中除了含有工艺当中引入的有机溶剂外，还残留多个其他挥发性杂质。多篇文献报道过微生物发酵过程可产生挥发性杂质，其中梁华正[1]采用质谱对微生物挥发性代谢产物进行过研究。通过GC-MS，确证了杆菌肽锌产品中残留的主要挥发性杂质，其中主要包括甲醇（RRT 0.44）、乙醇（RRT 0.50）、丙酮（RRT 0.56）、2-丁酮（RRT 0.77）、二甲基丁腈（RRT 1.38）等。本文结合细菌类微生物代谢特征，从培养基引入、微生物代谢产物以及产品降解等方面，系统的考察分析了杆菌肽锌产品中挥发性杂质的主要来源。

1 材料和方法

1.1 试验试剂和仪器

发酵用培养基、各步中间体和成品均由华北制药华胜有限公司提供，分析用试剂均为分析纯。

主要仪器：分析天平（万分之一）、安捷伦GC色谱仪（Agilent，DB-5毛细管柱）。

1.2 试验方法

确定某批发酵罐，从发酵培养基准备开始，取混合后的培养基，用GC色谱仪进行检测。按照生产要求在培养基内接入地衣芽孢杆菌，经发酵培养获得发酵液，放至过滤进行酸化、过滤等预处理得到中间体1，再经提取、纯化、精制、结晶及干燥等工艺过程，分别获得中间体2、中间体3、中间体4、中间体5及最终杆菌肽锌成品。再用GC色谱仪分别检测培养基、发酵液、各步中间体和成品，考察各挥发性杂质在工艺流程中产生或去除的趋势。（注：中间体的挥发性杂质含量是指GC图谱中各挥发性杂质峰面积所占图谱面积总和的比例。）

2 结果与讨论

2.1 甲醇（RRT 0.44）来源分析

成品中挥发性杂质甲醇的趋势如图1。从杂质追踪趋势分析可知，成品检测出的甲醇，自发酵培养基就存在，而且含量较高，在之后的提取、纯化工序逐步降低，而在成品中出现回升，推测该杂质是发酵培养基引入的挥发性杂质，同时产品也可降解产生该杂质。

2.2 乙醇（RRT 0.50）来源分析

成品中挥发性杂质乙醇的趋势如图2所示。从杂质追踪趋势分析可知，成品检测出的乙醇，自发酵培养基就存在，在发酵结束获得的发酵液、中间体1中维持在较高水平，后经经提取、纯化工序，中间体3中所含乙醇含量逐步降低至较低水平，推测为该挥发性杂质是主要由发酵培养基引入，并在提取后工序能够有效去除。

2.3 丙酮（RRT 0.56）来源分析

成品中挥发性杂质丙酮的趋势如图3所示。从杂质追踪趋势分析可知，成品检测出的丙酮，自发酵培养基就存在，在之后的提取、纯化工序逐步降低，而在成品中出现存在回升现象，推测为该杂质是发酵培养基引入的挥发性杂质，同时产品也可降解产生该杂质。在生产中间体2工序时物料为碱性，推测可能是产品在碱性条件下的降解产物。

2.4 2-丁酮（RRT 0.77）来源分析

成品中挥发性杂质2-丁酮的趋势如图4所示。从杂质追踪趋势分析可知，成品检测出的2-丁酮在发酵培养基中不存在，发酵培养结束后出现该杂质，含量较高，再经提取、纯化等过程，该挥发性杂质可除去大部分，推测该杂质为发酵过程微生物代谢产生的挥发性杂质。

图1 挥发性杂质（甲醇）趋势图

图2 挥发性杂质（乙醇）趋势图

图3 挥发性杂质（丙酮）趋势图

图4 挥发性杂质（2-丁酮）趋势图

2.5 二甲基丁腈（RRT 1.38）来源分析

成品中挥发性杂质二甲基丁腈的趋势如图5所示。从杂质追踪趋势分析可见，成品检测出的二甲基丁腈杂质（RRT 1.38），在中间体3生产过程首次产生，但残留水平较低，后工序可将该杂质有效去除，成品中该杂质出现升高趋势，推测该杂质是干燥过程因高温降解产生的挥发性杂质。

2.6 培养基引入挥发性杂质考察

为追踪考察发酵培养基中发现的可挥发性杂质，结合地衣芽孢杆菌发酵培养基种类进行了排查，经查阅文献发现，在杆菌肽锌发酵过程所用培养基黄豆饼粉存在多种挥发性物质。因此用GC色谱仪方法对发酵培养基用黄豆饼粉进行了检测，检测结果见表1，黄豆饼粉中主要挥发性杂质分布如图6所示。

表1 黄豆饼粉试验考察数据表

检验数据表明，培养基产生的挥发性物质甲醇（RRT 0.44）、乙醇（RRT 0.50）和丙酮（RRT 0.56）与文献报道的黄豆饼粉中挥发性物质基本相符[2]，同时黄豆饼粉中未检出2-丁酮和二甲基丁腈两种挥发性杂质，这与杆菌肽锌挥发性杂质流程考察结果一致[3]，结果证实，培养基消后产生的挥发性物质主要来源于黄豆饼粉。

图6 黄豆饼粉中主要挥发性杂质分布图

3 结论

通过对杆菌肽锌生产工艺流程考察、黄豆饼粉考察，证实甲醇、乙醇、丙酮主要来源于发酵培养基引入；产品碱性条件下降解也可产生丙酮；2-丁酮主要是发酵微生物代谢产生的挥发性杂质；二甲基丁腈主要为干燥过程因高温降解产生的挥发性杂质。以上考察数据为进一步采取有效措施，降低挥发性杂质引入来源和控制工艺过程降解提供了思路[4-5]。