蔓三七叶黄酮提取工艺优化及其体外抗氧化活性研究

涂招秀，谢欣，胡居吾＊，黄斌华

（1.江西省科学院，江西南昌 3300962；2.江西华紫仁农业开发有限公司，江西赣州 330000）

蔓三七，又名平卧菊三七、蛇接骨、续命草、神仙草，其味辛、微苦、性凉，为多年生草本药食两用植物。蔓三七茎叶营养丰富，富含粗多糖和绿原酸，同时还含有总黄酮、维生素A、维生素C、氨基酸，富含有机钙等成分。民间利用其通经活络，消肿止痛，消炎止咳，治疗跌打损伤，支气管肺炎、肺结核等[1]。

现代生物化学和医学研究证明，蔓三七具有通经活络，消炎止咳，散淤消肿，活血生肌等功效[2]；能延缓衰老、激活免疫细胞、改善机体免疫功能、提高人体免疫力，增强人体的新陈代谢并对记忆障碍有一定改善作用[3]；具有降血压、降血糖和预防慢性肾病、抑制乙型肝炎的显著效果[4]；对预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病等有一定的疗效[5]；还具有抗病毒、抗菌活性、抑制骨髓癌和志贺样毒素细胞的活性[6]。可广泛利用于食品医药工业、日用化工等领域，是一种极具潜力和高经济价值的药食两用植物。黄酮类化合物是蔓三七叶的主要活性成分之一，其中主要含芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷等[7]。

动态超高压微射流技术能对物料起到强烈的剪切作用，并能产生高频振荡效果，同时给物料带来高速的撞击和压力瞬间释放等一系列的相互作用，从而导致物料的细胞或细胞壁破碎，从而使物料的活性成分溶出，而且它不会影响物料中的活性成分[8]。目前，动态超高压微射流技术常用在对植物多糖的提取[9-10]、蛋白质改性[11]等。运用动态超高压微射流技术来提取黄酮的研究相对较少。

本文先采用进行单因素实验，并在此基础上，采用响应面法，以蔓三七叶黄酮得率（Y）为响应值，优化提取工艺；再以总抗氧化能力和对DPPH·和·OH清除率来评价蔓三七叶黄酮的抗氧化活性，研究结果对开发天然抗氧性化合物，综合利用蔓三七叶资源，提高蔓三七叶的附加值具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔓三七叶，江西华紫仁农业开发有限公司，烘干、粉碎后过20目筛备用。

芦丁标准品，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），Westgene公司；2,2-连氨基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、AAPH、Trolox，Aladdin 公司。其余试剂均为国产分析纯。

MFIC高压微射流均质机（M-700 Series），美国Microfluidics公司；高压均质机（GY50-6S），上海华东高压均质机厂；可见分光光度计（722G），上海驰唐实业有限公司；电子分析天平（AL104），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蔓三七叶黄酮提取的流程

蔓三七叶粉末→一定浓度的乙醇浸泡→过夜→高压预均质（30 MPa，2次）→动态超高压微射流均质→乙醇冷凝回流提取（70 ℃，2次）→ 合并提取液→离心→抽滤→测定吸光度→计算黄酮得率。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制[12]

精确称取在干燥温度为120 ℃下干燥至恒重的芦丁标准品0.200 0 g，置于100 mL容量瓶中，往容量瓶中加入80%乙醇70 mL，置于50 ℃水浴上边加热边摇晃使其溶解，溶解完全后再冷却至室温，往容量瓶中再加入乙醇至刻度，摇匀。精密吸取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL和7.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，先加乙醇6 mL，其次往容量瓶中加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min后，再容量瓶中加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，最后加5%氢氧化钠试液10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以乙醇为参比，用1 cm比色皿，于紫外可见分光光度计上，在400～600 nm波长处进行扫描。结果表明，对照品溶液在510 nm处有最大吸收，因此选择510 nm作为测定波长。在510 nm波长处测定体系的吸收度，绘制标准曲线，其中纵坐标为吸收度（A），横坐标为溶液浓度。标准曲线方程为A=0.001x+0.0392，相关系数R2=0.999，线性范围在0～100 mg/mL。

1.2.3 单因素实验

影响蔓三七叶黄酮得率的主要因素包括提取温度、乙醇浓度、提取时间、提取次数、微射流均质压力和料液比等。通过前期的研究，确定液料比为15 mL/g，提取次数为2次。本实验主要研究对蔓三七叶黄酮得率影响较大的因素有提取温度、乙醇浓度、提取时间和微射流均质压力4个因素对蔓三七叶黄酮得率的影响。

1.2.4 正交实验设计

在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度（A）、提取时间（B）和微射流均质压力（C）3个因素为自变量，由于提取温度变化不显著，设定为65 ℃。根据Box-Behnken中心组合设计原理，以蔓三七叶黄酮得率（Y）为响应值。因素水平编码见表1。

表1 中心组合实验设计因素水平

1.2.5 蔓三七叶黄酮体外抗氧化活性研究

1.2.5.1 总抗氧化能力的测定

参照李雪等[13]人方法，采用试剂盒测定蔓三七叶黄酮总抗氧化能力。按照T-AOC测定试剂盒说明书进行操作进行。根据公式（1）计算蔓三七叶黄酮及维生素C的总抗氧化能力（η总）：

式中：

N=反应体系稀释倍数（反应液总量/取样量）；

n=样品测试前稀释倍数。

在37℃时，每分钟每毫升样品使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为一个总抗氧化单位。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照Najafian[14]等人方法，测定蔓三七叶黄酮对DPPH自由基清除效果。最后根据公式（2）计算蔓三七叶黄酮及维生素C的DPPH自由基清除率（ηDPPH）

1.2.5.3 OH自由基清除能力的测定

参照李雪[13]等人方法，测定蔓三七叶黄酮对OH自由基清除效果。最后根据公式（3）计算蔓三七叶黄酮及维生素C的OH自由基清除率（η·OH）：

1.3 数据处理

采用SPSS17.0进行单因素方差分析、Origin8.5软件作图、Design-Expert 8.0.6软件进行响应面设计和统计学分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g干燥的蔓三七叶粉末（过20目），按上述的液料比15 mL/g（体积/重量）加入分别为50%、60%、70%、80%和90%乙醇溶液，先经过30 MPa预均质后，在80 MPa微射流压力下处理2次，65 ℃ 水浴提取1.5 h，提取两次。

由图1可知，蔓三七叶黄酮得率在50%～70%乙醇浓度范围内，随着乙醇浓度的上升而增大，并且在乙醇浓度为70%时达到最大值，此时得率为1.93%；在乙醇浓度70%～90%的范围内，随着乙醇浓度继续上升，蔓三七叶黄酮得率缓慢下降，在乙醇浓度为90%时，蔓三七叶黄酮得率为1.82%。其原因可能是当乙醇浓度大于70%，物料中的叶绿素等脂溶性杂质大量的溶出，从而影响了黄酮物质的溶出率。因此，选择乙醇浓度为70%较合适。

图1 乙醇浓度对蔓三七叶黄酮得率的影响

2.1.2 提取温度对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15 mL/g加入70 %浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，立刻在80 MPa微射流压力下处理2次，提取温度选择 50、55、60、65 ℃和 70 ℃ 水浴提取 1.5 h，提取2次，结果如图2所示。

由图2可知，在提取温度为50～65 ℃范围内，蔓三七叶黄酮得率随着提取温度的上升而有所增加，但曲线上升趋势不是太显著，在提取温度为50 ℃时，蔓三七叶黄酮得率为1.82%，而在提取温度为65 ℃时，蔓三七叶黄酮得率为1.90%。当提取温度超过65℃后，蔓三七叶黄酮得率随着温度的上升（70 ℃）而缓慢下降，其原因可能是蔓三七叶黄酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，选择提取温度为65 ℃较合适。

2.1.3 提取时间对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15 mL/g加入70%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，立刻在80 MPa微射流压力下处理2次，提取温度65 ℃水浴提取，提取时间分别选择0.5、1、1.5、2 h和2.5 h，提取2次，结果如图3所示。

图2 提取温度对蔓三七叶黄酮得率的影响

由图3可知，在提取时间为0.5～1.5 h范围内，蔓三七叶黄酮得率会随着提取时间的延长而增加，且蔓三七叶黄酮得率升高较快。在提取时间超过1.5 h后，蔓三七叶黄酮得率有下降的趋势。因此，选择提取时间为1.5 h较合适。

图3 提取时间对蔓三七叶黄酮得率的影响

2.1.4 微射流均质压力对蔓三七叶黄酮得率的影响

分别称取100.00 g蔓三七叶粉末，按液料比15 mL/g加入70%浓度的乙醇，浸泡过夜，经30 MPa预均质后，分别在立刻微射流均质压力选择60、70、80、90 MPa和100 MPa下处理2次，提取温度65 ℃水浴提取1.5 h，提取2次，结果如图4所示。

相对于普通提取和高压预均质后提取，微射流均质后再提取时，使得蔓三七叶黄酮得率随着均质压力的加大而显著提高，因为体系中均质压力越大，使得物料细胞的破碎程度越高，从而使得物料中黄酮物质等有效成分更完全的溶出。从图4可知，蔓三七叶黄酮的得率在微射流均质压力为90 MPa时达到最大值，蔓三七叶黄酮的得率达到1.94%。而后随着均质压力的进一步加大，蔓三七叶黄酮得率趋于平缓且略微下降。因此，微射流均质压力90 MPa时，蔓三七叶黄酮得率最大。

图4 微射流均质压力对蔓三七叶黄酮得率的影响

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

单因素实验结果表明，乙醇浓度、提取时间、微射流均质压力是影响得率的三个最主要的因素，由于提取温度变化不显著，设定为65 ℃，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以蔓三七叶黄酮得率（Y）为响应值，进行响应面试验，结果见表2。

表2 试验设计及结果

采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件对表2中的17个试验点的响应值进行多元回归拟合后得到黄酮得率与各因素的二次多项回归方程模型 R：

Y(%)=2.04-0.041A+0.026B+0.048C+0.030AB+0.0 13AC+0.017BC-0.12A2-0.085B2-0.14C2

由表3分析结果可知，表中F值越大表明该因素对黄酮得率影响越大，各因素对黄酮得率的影响大小依次为：均质压力（C）、乙醇浓度（A）、提取时间（B）。对该模型进行方差分析，结果见表3，整体模型的显著性检测p＜0.01，且失拟项为0.623 4，不显著，说明该方程对试验拟合较好，在此模型中A2、B2和C2是极显著性因子项（p＜0.01），而B、AB、AC、BC无显著性差异（p＞0.05）。

其中校正决定系数R2Adj=0.876 9＞0.80和变异系数（CV）为2.31%，可用来对提取蔓三七叶黄酮的工艺过程进行初步分析和预测。

表3 回归模型的方差分析

2.2.2 验证试验

通过Design-Expert8.0.6 软件求解方程，系统预测得出蔓三七叶黄酮得率的最佳工艺条件为：乙醇浓度67.56 %、提取时间68.06 min和均质压力79.57 MPa，在此条件下，模型预测得到黄酮得率为2.07%。为了检验响应面优化试验所得到结果的可靠性，考虑到实际操作因素，将上述条件修正为：乙醇浓度68.0%、提取时间68 min和均质压力80 MPa，在此条件下黄酮得率为2.08%。黄酮得率实际值与预测理论值未发现显著性差异（p＞0.05），证明运用试验建立的数学模型进行预测在实践中是切实可行的，适用于工业生产。

2.3 蔓三七叶黄酮的抗氧化活性

2.3.1 总抗氧化能力

不同质量浓度蔓三七叶黄酮总抗氧化能力见图5。由图5可见，在各浓度下蔓三七叶黄酮总抗氧化能力与对照品维生素C的总抗氧化能力较接近，两者的溶液浓度在0.8 mg/mL时，蔓三七叶黄酮总抗氧化能力值为（11.25±0.45）U/mL，维生素C总抗氧化能力值为（13.56±0.50）U/mL，蔓三七叶黄酮总抗氧化能力达到了维生素C总抗氧化能力值的90%以上，并且随着溶液浓度增大，两者的抗氧化能力都增强。可以看出，蔓三七叶黄酮总抗氧化能力较强。

图5 蔓三七黄酮总抗氧化能力

2.3.2 对DPPH自由基清除能力

不同质量浓度蔓三七叶黄酮对DPPH自由基清除能力见图6。在各浓度下蔓三七叶黄酮与维生素C的DPPH 自由基清除能力均随着质量浓度增大具有增强趋势。但蔓三七叶黄酮对DPPH 自由基清除能力低于Vc对DPPH 自由基清除能力，如在0.8 mg/mL时，蔓三七叶黄酮对DPPH自由基清除率为55.65%，而维生素C对DPPH 自由基清除率为90.2%。虽然蔓三七叶黄酮对DPPH自由基清除能力不及维生素C，但它对清除DPPH自由基还是具有较好的效果。

2.3.3 对OH自由基清除能力

不同质量浓度蔓三七叶黄酮对OH自由基的清除能力见图7。在各浓度下蔓三七叶黄酮与维生素C的OH自由基清除能力均随着质量浓度增大具有增强趋势。蔓三七叶黄酮对OH自由基清除能力稍低于维生素C对OH自由基清除能力，在0.8 mg/mL时，蔓三七叶黄酮对OH自由基清除率为70.25%，维生素C对OH自由基清除率为86.7%，此浓度下蔓三七叶黄酮对OH自由基清除能力达到维生素C的80%以上，说明蔓三七叶黄酮对OH自由基清除能力较强。

图6 蔓三七黄酮对DPPH自由基清除能力

图7 蔓三七黄酮对OH自由基清除能力

3 结论

采用动态超高压微射流技术提取蔓三七叶黄酮，通过单因素与响应面实验，建立了蔓三七叶黄酮得率的回归模型。该模型测得出蔓三七叶黄酮得率的最佳工艺条件为：乙醇浓度68.0%、提取时间68 min和均质压力80 MPa，在此条件下黄酮得率为2.08%。在质量浓度0.2～1.0 mg/mL范围内，蔓三七叶中黄酮体外抗氧化活性呈现出量效关系趋势。0.8 mg/mL时，总抗氧化能力为（11.25±0.45）U/mL，达到相同溶液浓度的维生素C总抗氧化能力[（13.56±0.50）U/mL]的90%以上，各浓度蔓三七叶中黄酮对DPPH和·OH清除能力均有较强的清除能力，是一种良好的天然抗氧化剂。