毕赤酵母菌bFGF转化株的筛选及鉴定

国微，杨新朝，闫尧，姜锐

（北华大学理学院，吉林吉林 132013；吉林省中药生物技术创新中心，吉林吉林 132013）

碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，以下简称bFGF）是细胞生长和分化的重要调节因子，具有促血管生成、细胞增殖、细胞趋化、细胞迁移等活性，能促进愈合伤口产生胶原蛋白、纤维连接蛋白和基质酶的基质成分、抑制瘢痕形成,作为皮肤组织中的受体结合分子，bFGF启动皮肤细胞的生长、分裂和分化、恢复细胞的活性的作用，使bFGF的应用开始从临床进入护肤美容领域，并显示其对美容驻颜的巨大潜力，而被称为“二十一世纪的化妆品”，在皮肤美容方面具有十分广阔的开发利用前景。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前研究和应用较多的外源蛋白表达系统[1]，到目前为止已有400多个外源蛋白得到成功表达，是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一，也是具有前景的商业蛋白生产工具之一[2-3]。由于毕赤酵母表达系统的卓越性和bFGF的强大的生物功能，本实验室构建了毕赤酵母bFGF转化株，但菌种插入的bFGF基因是否能够得以表达，且表达量是否存在差异，本研究对转化株进行bFGF基因表达筛选及鉴定，并筛选出表达量较高的菌株作为菌种为后续大规模发酵奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

吉林省中药生物技术创新中心实验室构建的毕赤酵母菌bFGF转化株His+型，-80 ℃冰箱冻存菌种。

1.2 主要试剂及药品

RD液体培养基、RDB琼脂平板、RD顶层琼脂、MD平板、MM平板、YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基、试剂盒：Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit For Fibroblast Growth Factor2，Basic(FGF2)，Cloud-Cline Corp。

1.3 仪器

摇床（兴科THZ82A）、天平(HANGPING JY2002型)、立式压力蒸汽灭菌器（上海申安LDZX型）、恒温培养箱（博讯DNP-9002BS型）。

1.4 实验方法

1.4.1 毕赤酵母重组菌的Mut+Muts表型筛选[11]

取2010年冻存于-80 ℃冰箱的毕赤酵母菌bFGF转化株甘油冻存菌，编号9D和X各1管，解冻取100 μL，加入到10 mL融化的RD液体培养基中，轻摇震荡混匀，倾倒于RDB琼脂平板上，静置凝固后将平板倒置于28 ℃恒温培养箱内培养3 d，顶层琼脂中有大量转化株出现。于超净台内用无菌涂布器刮取顶层琼脂，放入到50 mL无菌离心管中，加入20 mL无菌去离子水制成悬浮液，通过漩涡震荡使菌从琼脂中分离出来。用4层无菌纱布过滤去除琼脂，剩余滤液用8000rpm离心5分钟，菌体沉淀在离心管底部，小心剥离上层的琼脂，轻轻将上清倒掉，加入5 mL无菌去离子水重悬菌体。蘸取重悬液在MD平板上划线，倒置于30 ℃恒温培养箱内培养。2 d后用牙签挑取单克隆，同时在MD和MM平板的同一位置接种，30 ℃恒温培养箱倒置培养。

1.3.2 bFGF转化株测序及比对

36 h后，选取即在MM又在MD培养基上生长的单克隆接种入10mlYPD培养基中，分别编号9d1～9d6、x1～x5，置于摇床200 r/min，28 ℃，约24 h菌液OD600＞2时停止培养，取5 mL培养液离心弃上清，沉淀送上海生工生物工程有限公司测序。

测序结果通过Blast进行序列比对，确定目的基因是否为bFGF。

1.3.3 转化株bFGF表达量筛选

取确定为bFGF转化株的YPD培养液200 μL加入到20 mL BMGY培养基中扩大培养，其余加入15%甘油后分装冻存。BMGY培养约24 h后停止，8000rpm离心5分钟，弃上清，加入BMMY培养基重悬菌体至OD600=1.0，取20 mL为一瓶，置于摇床28 ℃，200 r/min震荡培养，添加甲醇保持甲醇终浓度0.5%。4 d后，8000rpm离心10 min，取上清液冻干、称重。试剂盒测定各菌株bFGF表达量。

2 结果与分析

2.1 Mut+Muts 表型筛选结果

Mut+为甲醇利用型，既在MD培养基上生长，又在MM培养基上生长，Muts为甲醇缓慢生长型，只在MD培养基上生长。实验结果（图1）显示从编号9D、X的毕赤酵母重组菌中挑取的共99个单克隆均为Mut+型。

图1 单克隆表型筛选结果

2.2 测序及比对

菌样送上海生工生物工程有限公司检测。使用通用引物对菌体基因组进行扩增，结果如表1所示。9d1、9d2、9d3、9d6、x2、x3、x4、x5均含有插入片段，对插入片段PCR产物进一步测序，测序结果通过BLAST进行序列比对，显示插入的目的片段与人FGF2基因序列系列相似度为100%，即以上菌株确定为bFGF转化株。且11个单克隆中有8个检出目的基因，确定毕赤酵母菌bFGF转化株可表达bFGF基因。

2.3 转化株表达bFGF能力筛选

使用试剂盒对不同转化株单克隆发酵液的bFGF表达量进行测定，结果如表2所示。其中，9d3表达量最高，冻干粉中bFGF含量为0.27 ng/g，发酵液表达量为13.14 ng/L。因此，适宜选取9d3作为后续大规模发酵的菌种。

表1 PCR及序列比对结果

图2 9d3的PCR产物序列与bFGF基因序列比对情况

表2 不同单克隆bFGF表达量情况

图3 不同单克隆bFGF表达量情况

3 讨论

重组质粒在酵母菌中的稳定存在是决定外源基因高效稳定表达的前提[1]。尽管重组毕赤酵母菌表达菌株较其他工程菌而言遗传稳定性较高，但是也会出现较少的遗传丢失现象，同时子代个体间也会出现一定的差异性[8]。基因工程菌的遗传稳定性直接影响重组蛋白的表达，分离纯化，乃至后期的产业化生产[9]，为了获得高表达的转化株，本实验对构建的bFGF转化株进行筛选及鉴定，实验结果显示重组毕赤酵母菌中挑取的共99个单克隆均为Mut+型，表型稳定；且11个单克隆中有8个检出目的基因，说明转化株稳定性较高；对8个检出目的基因的单克隆进行bFGF表达能力筛选，表达能力各有不同，其中9d3表达量最高，发酵液表达量为13.14 ng/L。因此，适宜选取9d3作为后续大规模发酵的菌种。本研究对重组毕赤酵母菌进行了鉴定，并筛选出高表达菌株为后续大规模发酵提供菌种。