苦瓜中α-葡萄糖苷酶抑制剂的超滤质谱筛选研究

郭力菲，侯万超，赵婉伊，赵红磊，牛俊博，宋吉玲，孙鸣悦，何文丽，刘春明＊

（长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032）

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种临床常用的口服降糖药物，它能够抑制小肠内α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道内的吸收，从而达到降低餐后高血糖的作用[1-2]。目前，从天然药物或者植物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究已成为热点。苦瓜（Momordica charantia）为葫芦科苦瓜属植物，其根、茎叶及果实皆可入药，具有清热解毒的作用[3]。苦瓜果实也是一种经常食用的蔬菜，很多文献报道其化学成分具有很好的降血糖功效[4-6]。董义研究了6种保健食品原料的降糖效果，认为苦瓜的降糖效果最好[7]。彭晓赟等[8]研究了苦瓜根总皂苷提取物对α-葡萄糖苷酶活性的作用，并得到α-葡萄糖苷酶抑制活性最好的皂苷提取工艺。刘慧娟等[9]研究了7种苦瓜皂苷单体化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，证明皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质基础。从苦瓜提取物中筛选出有效的活性成分，不仅能了解其降糖机制，还能为寻找新的治疗糖尿病药物提供实验基础。

超滤质谱技术是将超滤技术与质谱技术结合的一种药物筛选方法[10-11]，主要是利用亲和原理将含有潜在活性的小分子物质与受体混合，形成复合物，通过超滤膜滤去未结合的小分子物质，以有机溶剂处理释放小分子配体，并采用液相-质谱联用技术进行鉴别。该方法具有分析速度快、无需预处理过程等优点，在药物筛选过程中具有广阔的应用前景。

本研究选择α-葡萄糖苷酶作为药物靶点，利用离心超滤和液相色谱-质谱联用的方法，从苦瓜提取物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，并利用LC-MS技术对筛选出的活性成分进行结构鉴定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Agillent 1260 Infinity型高效液相色谱仪，配备UV检测器（Agillent，美国）；Q Extractive 质谱仪（）hermo Scientific，美国）；3-30K高速冷冻离心机（Sigma，德国）；G3旋转蒸发仪（Heidolph，德国）；THZ-D恒温振荡器（大仓市实验设备厂）；Integrel 3超纯水仪（Millipore，美国）。

苦瓜片，购自中东万家医药超市（长春）；α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, 100U），购自美国sigma公司；YM-10型Microcon超滤管，购自美国Millipore公司；醋酸铵（分析纯），购自天津科密欧试剂有限公司；乙腈（HPLC），购自美国Fisher公司；甲醇（分析纯），购自北京化工厂；实验用水为Millipore超纯水。

1.2 样品处理

取自然风干的苦瓜片，用粉碎机粉碎过60目筛。准确称取10.0g苦瓜干粉，按料液比1∶10加甲醇回流提取1h，过滤后，滤渣进行同样条件的二次提取，将两次提取的滤液合并浓缩至样品浓度为0.5 g/mL，过0.45μm滤膜，待用。

1.3 离心超滤筛选方法

分别移取50 μL 0.5 g/mL苦瓜提取物溶液和25 μL 1.0 U α-葡萄糖苷酶溶液，加入925 μL pH=6.8的10 mmol/L 的醋酸溶液中，置于37 ℃恒温振荡器中反应40 min，移取800 μL至截留分子量为10000的YM-10型超滤管中，于14000 r/min下超速离心30 min，向滤膜中加入100 μL 10 mmol/L的醋酸溶液（pH=6.8），离心清洗3次，洗去未结合成分。再向滤膜中加入100 μL甲醇（pH=3.3），在14000r/min下离心30min释放结合配体，重复2次，收集洗脱液，用于LC-MS分析。不加α-葡萄糖苷酶的空白实验处理方法同上。

1.4 LC-MS分析条件

色谱柱：5μm, 250mm×4.6mm；流动相：乙腈-水梯度洗脱（0min，40%乙腈；2min，60%乙腈；40min，100%乙腈；50min，100%乙腈）。流速：0.8mL/min。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；喷雾电压：3.3kV；鞘气流速：40psi（1 psi≈6.9 kPa）；辅助气流速：10 psi；毛细管温度320℃；辅助气温度320 ℃；S-Lens分辨率：50；扫描范围：m/z150～2000Da；质量分辨率：70000。

2 结果与讨论

2.1 苦瓜化学成分与α-葡萄糖苷酶生物亲和作用研究

苦瓜提取物与α-葡萄糖苷酶作用和与不加α-葡萄糖苷酶的空白实验的高效液相色谱图如图1所示。当苦瓜提取物中的化学成分与α-葡萄糖苷酶发生特异结合后，α-葡萄糖苷酶捕获的配体所对应的峰面积均大于其空白对照。图1表明，苦瓜提取物中有5个化学成分与α-葡萄糖苷酶结合。

通过分别对比5个化合物在两种不同实验条件下的液相色谱图1a和图1b，考察化合物与α-葡萄糖苷酶的结合能力，结果如图1所示。由图1可知，在控制变量保证其它实验条件相同的情况下，该5个化合物与α-葡萄糖苷酶作用和与不加α-葡萄糖苷酶的空白实验的液相色谱比值明显较大。因此由图1a和图1b可推测该5个化合物与α-葡萄糖苷酶具有结合作用，可以抑制α-葡萄糖苷酶生物活性，具有潜在的2型糖尿病活性。

图1 苦瓜提取物的离心超滤HPLC图(a-与α-葡萄糖苷酶作用、b-空白试验)

2.2 液相色谱-质谱联用分析和结构鉴定

根据超滤亲和筛选出的5种化合物的保留时间和特征离子峰（表1），结合参考文献进行解析，结果见图2。

化合物1（tR25.86 min）的ESI-MS图谱显示，m/z 687.38[M+K]+，m/z 671.32[M+Na]+，由此判断该化合物的相对分子量为648。苦瓜皂苷K的分子式为C37H60O9，计算其相对分子质量为648，与此质谱信息吻合。图谱中还显示m/z 666.46[M+H2O]+,m/z 437[M+H-162-H2O-CO2]，其中162代表失去一个葡萄糖基，进一步确定了该化合物的结构[9]。

化合物2（tR31.56min）的ESI-MS图谱显示，m/z 511.32[M+K]+, m/z 495.34[M+Na]+，由此判断该化合物的相对分子量为472。苦瓜素I的分子式为C30H48O4，计算其相对分子质量为472，与此质谱信息吻合。图谱中还显示m/z 437.34[M+H-2H20]+，m/z 419.33[M+H-3H2O]+进一步确定了该化合物的结构[12]。

化合物3（tR32.98min）ESI-MS图谱显示，m/z 671.39[M+K]+, m/z 655.34[M+Na]+, 633.44[M+H]+，计算其相对分子质量为632。苦瓜皂苷G的分子式为C37H60O8，计算其相对分子质量为632，与此质谱信息吻合。图谱中还显示m/z 471.38[M+H-162]+，m/z 439.36[M+H-162-CO2]+，进一步确定了该化合物的结构[6]。

化合物4（tR34.50min）ESI-MS图谱显示，m/z 701.40[M+K]+，m/z 685.43[M+Na]+，计算其相对分子质量为632。未能找到与之对应的化合物。

化合物5（tR35.88min）ESI-MS图谱显示，m/z 525.33[M+K]+，m/z 509.36[M+Na]+，m/z 633.44[M+H]+，计算其相对分子质量为486。查阅文献发现，(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol和 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol的分子式为C31H50O4，理论分子质量为486，与此质谱信息吻合[13]。

表1 苦瓜提取物中的活性成分鉴定

3 结论

通过超滤-质谱方法从苦瓜提取物中筛选出5种具有潜在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化学成分，其中4种经初步鉴定为苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol），1种暂未确定其结构。本研究为进一步开发基于苦瓜的降糖产品提供了依据。

图2 化合物1～5的质谱数据

（a、b、c、d、e依次为苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、未知、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol）