低分子肝素钠对阿霉素肾病综合征大鼠糖萼及血浆TNF-α、IL-6的影响※

舒丽霞，罗朋立

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海大学附属医院肾病科，青海 西宁 810001)

肾病综合征(nephrotic syndrome，NS)是以大量蛋白尿为特征的一组疾病。蛋白尿的产生与肾小球滤过膜的三层结构(内皮细胞、基底膜、足细胞)密切相关。近年来有学者发现内皮细胞表面有一层蛋白质多糖复合物(也叫糖萼，Glycocalyx，GCX)，其与尿蛋白的产生密切相关[1]。GCX是血管内皮表面的一层蛋白质多糖复合物，其核心分子是蛋白多糖和糖蛋白(主要包括syndecans、glypicans等)；由核心蛋白通过O-糖基键与无支链糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)侧链相连接；NS时GCX层结构被严重破坏，加之血浆TNF-α水平升高使内皮GCX孔径增加，致出现大量蛋白尿和严重的低白蛋白血症[2]；由于白蛋白有助于GCX的修复，NS时大量的蛋白尿导致血浆白蛋白的流失，加重了肾小球内皮GCX的损伤[3]。GAG中含量最多的是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)，超过体积的50%，还有透明质烷(Hyaluronan，HA)、硫酸皮肤素(Dermatan sulfate，DS)[4]。主要的功能GAG是HS，HS作为电荷屏障阻止血液中带负电荷的蛋白质从尿液中损失，而乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE)能在特定的位点切割HS链内的糖苷键，从而断开硫酸乙酰肝素-糖蛋白(Heparin sulfate proteoglycans，HSPG)的链接[5]。HPSE在实验性肾小球疾病如阿霉素肾病、嘌呤毒素肾病及其他肾小球疾病等导致蛋白尿的疾病中表达上调，并伴随着HS的减少[5-7]。另外，多种炎性因子参与NS的发病，如肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-6(IL-6)等参与细胞免疫和体液免疫，介导肾脏损伤[8-9]，可直接损伤肾小球和足细胞，导致大量蛋白尿[10-11]。

NS患者全身血管系统处于高凝状态；NS的治疗药物如皮质固醇类激素、利尿剂等可加重NS患者的高凝状态。抗凝治疗是NS的一个重要辅助治疗手段，LMWH因具有生物利用度高、副作用少等特点在临床上被广泛应用。随着研究的深入，发现LMWH在多种疾病中通过非抗凝机制发挥脏器保护作用，包括对肾脏功能的保护。

本研究拟观察LMWH对原发性肾病模型大鼠的治疗作用及其对肾脏GCX，血浆TNF-α、IL-6的影响，探讨其对阿霉素NS大鼠的治疗作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠30只，8周龄，体重(200±20)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2017-003；适应性饲养一周，自由进食、饮水。实验室环境：12小时明暗交替。

1.1.2 主要试剂及仪器

盐酸阿霉素(北京索莱宝科技有限公司；货号：D8740，25mg/支)；LMWH(齐鲁制药有限公司；国药准字：H20030428，0.2mL/2500IU)。兔抗大鼠Syndecan-1一抗[abcam；货号：ab128936，100μL(1.123mg/mL)]；兔抗大鼠Glypican-1一抗[abcam；货号：ab106003，100μg(2.1mg/mL)]；α-Tublin、山羊抗兔二抗(索莱宝公司)；RIPA蛋白裂解液(索莱宝公司)。白蛋白检测试剂盒(南京建成公司；货号：A028-2；96T)；BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞公司)；2×蛋白上样缓冲液(索莱宝公司)；ELISA试剂盒(TNF-α、IL-6、HS、HPSE、Syndecan-1均购自武汉华美生物工程有限公司)；总胆固醇(T-CHO)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A111-1；96T)。电泳仪、转膜仪(Bio Rad公司)；酶标仪(Bio Rad公司；MPM6)；KD-BMⅡ电脑生物组织包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；大鼠代谢笼(江苏塞昂斯生物科技)。

1.1.3 NS模型

适应性饲养一周后，参照文献[12]造模。注射阿霉素3周后用代谢笼收集24小时尿液，收集尿液期间禁食，自由饮水；造模成功后于皮下注射LMWH。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理

6只大鼠设为正常对照组，24只经尾静脉注射阿霉素(共6.0mg/kg)制备NS模型设为模型组和治疗组。注射阿霉素20天后用代谢笼收集大鼠24小时尿液，记录尿量并检测尿蛋白含量，24小时尿蛋白大于等于200 mg的大鼠视为造模成功[12]，最后大鼠被分为正常对照组(6只)，模型组(6只)，LMWH治疗5、7、9天组(其中两组各有1只造模不成功，另一组有一只大鼠产生大量腹水并死亡)；正常对照组和模型组经皮下注射生理盐水(0.1mL/d/只)，各LMWH治疗组经皮下每天注射LMWH(200IU/只)，分别在给药后的第5、7、9天收集24小时尿液，检测尿蛋白含量。

1.2.2 标本收集

给药后第5、7、9天分别收集各LMWH治疗组大鼠24小时尿液离心(3000转/分钟，15分钟)，去除沉渣后置冰箱(-20℃)保存待测；用3%的戊巴比妥钠(0.15mL/kg)于腹腔注射麻醉大鼠，从肾静脉采血离心(3000转/分钟，15分钟)，取上清液置冰箱(-20℃)保存待测。采血后结扎肾蒂，摘取肾脏组织置冰箱(-80℃)保存待行WB检测，另取肾脏组织浸泡于4%多聚甲醛固定后行HE染色。最后再收集正常对照组及模型组大鼠24小时尿液及大鼠血浆和肾脏组织。

1.2.3 指标检测

用试剂盒分别检测血浆白蛋白含量及尿蛋白含量；血浆HS、HPSE、Syndecan-1、TNF-α、IL-6含量；血总胆固醇。

1.2.4 HE染色

先将浸泡在4%多聚甲醛里的肾皮质包埋(在KD-BMⅡ电脑生物组织包埋机中进行)，包埋后切片(5μm)，按照预实验条件进行梯度酒精浸泡后染色、脱色、镜下观察。

1.2.5 WB检测

提取组织蛋白后，用BCA法测定蛋白浓度，按SDS-PAGE凝胶试剂盒说明配置10%的分离胶及5%浓缩胶，上样前加入2×蛋白上样缓冲液，每孔上样30 μg后开始以80 V电泳15分钟，再切换至120 V约80分钟，待蛋白样本达到分离胶的底部时，停止电泳。用激活的PVDF膜覆盖后用恒定电流(200mA)转膜2小时，取出PVDF膜，浸泡于脱脂牛奶中封闭(室温)1小时后置封口袋封闭孵育(4℃冰箱内过夜)相应一抗，用1×TBST液清洗7次(7min/次)。室温下孵育相应二抗1小时，洗膜后用ECL化学发光成像系统显影。

1.2.6 统计学处理

2 结果

2.1 LMWH对NS大鼠蛋白尿的影响(表1)

与NS模型组比较，各LMWH治疗组大鼠24小时尿蛋白含量均有所降低，给药7天开始差异具有显著性，与模型组相比有统计学意义，但各给药组间尿蛋白含量差异不明显。

2.2 LMWH对NS大鼠血浆总胆固醇及血浆蛋白含量的影响(表2)

与正常对照组相比，NS模型组血浆总胆固醇(Total Cholesterol；TC)含量明显增加，在给药后第9天血总胆固醇含量明显减少(P<0.05)；与正常对照组比较，模型组血浆白蛋白显著减少，LMWH治疗7天组出现血浆白蛋白水平升高(P<0.05)。

2.3 LMWH对NS大鼠血浆GCX的影响(表3)

与正常对照组比较，模型组大鼠血浆Syndecan-1、HS含量较高；经LMWH治疗后血浆HS含量明显下降，Sydecan-1含量升高，治疗9天开始出现下降趋势(P>0.05)；HPSE含量较模型组增加(P<0.05)。

2.4 LMWH对NS大鼠肾皮质GCX核心蛋白Syndecan-1和Glypican-1含量的影响(表4，图1)

与正常对照组比较，模型组大鼠Glypican-1、Syndecan-1含量显著减少(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组肾小球内皮Glypican-1、Syndecan-1含量增加。

Table 1Effect of LMWH on urinary protein in rats with

#：与模型组比较，P<0.05；*：与正常对照组比较，P<0.05

Table 2Effect of LMWH on plasma TC and albumin levels in NS

#：与模型组比较，P<0.05；*：与正常对照组比较，P<0.05

Table 3Effect of LMWH on plasma HS，HPSE and Syndecan-1，contents in NS

#：与模型组比较，P<0.05；*：与正常对照组比较，P<0.05

Table 4Result of Glypican-1 and Syndecan-1 contents in kidney of NS rats by

#：与模型组比较，P<0.05；*：与正常对照组比较，P<0.05

1：正常对照组 2：模型组 3：LMWH5天组 4：LMWH7天组 5：LMWH9天组

2.5 LMWH对NS大鼠血浆TNF-α和IL-6的影响(表5)

与正常对照组比较，肾病模型组大鼠血浆TNF-α、IL-6含量明显增加(P<0.05)；经LMWH治疗后两者有下降趋势，TNF-α在治疗9天时血浆水平较肾病模型组明显减少(P<0.05)，血浆IL-6含量在给药7天后明显降低(P<0.05)。

Table 5The effect of LMWH on plasma TNF- α and IL-6 in NS

#：与模型组比较，P<0.05；*：与正常对照组比较，P<0.05

2.6 肾组织HE染色(图2)

与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织可见肾小球上皮细胞肿胀扩大，肾小球间质可见均质红染物质增多，少量单核细胞渗出，个别囊腔内见少量红细胞漏出，肾小管上皮细胞胞浆疏松化、体积增大，管腔内有大量透明管型，未见新月体、坏死及硬化；与模型组比较，各LMWH治疗组肾小球上皮细胞水肿程度减轻，肾小管内透明管型明显减少，肾小管上皮细胞胞质疏松化程度减轻。

对照组 模型组

低肝5天组 低肝7天组 低肝9天组

3 讨论

本实验采用阿霉素诱导NS模型，其临床表现近似于原发性NS，是公认的能够较好地模拟人类肾病的模型[13]。LMWH治疗后各组24小时尿蛋白含量较模型组明显减少，血浆白蛋白含量升高，血浆TC、HS、TNF-α、IL-6含量显著减少，HE染色结果显示治疗后肾小管内透明管型明显减少，提示LMWH是有效治疗NS的手段。

在本实验中，经LMWH治疗9天后血浆白蛋白含量得到回升，同时伴随着24小时尿蛋白、血浆TNF-α及IL-6、HS、TC含量显著减少。与田建梅[14]等用LMWH联合泼尼松作用于NS患儿，治疗一个月后患儿血浆总胆固醇、24小时尿蛋白含量明显下降的结果一致。LMWH因具有与HS相似的结构，可修复肾小球内皮GCX结构、降低肾小球滤过膜通透性，从而降低NS蛋白尿含量并提升血浆白蛋白水平[15]，对肾脏发挥保护作用。本实验发现，经LMWH治疗后大鼠血浆GCX(HS、Syndecan-1)含量较模型组减少，HPSE含量增加(P<0.05)。组织GCX(Glypican-1、Syndecan-1)含量增加(P>0.05)，可能与LMWH的血药浓度有关，因为LMWH以剂量依赖性方式防止GCX核心蛋白脱落，起到保护作用[2]，提示LMWH有修复GCX的作用。GCX得到修复后导致蛋白尿的产生减少，进而血浆白蛋白含量回升，而血浆白蛋白升高抑制了血浆TC的升高。

经LMWH治疗后大鼠血浆TNF-α、IL-6水平明显降低，可能与LMWH的抗炎作用有关。LMWH抗炎作用机制可能从抗凝机制和非抗凝机制两方面体现：抗凝机制主要是通过抑制FXa而发挥抗炎作用，凝血因子FXa是一类能促进炎症反应的酶，可通过G蛋白偶联受体-3激活炎症细胞；还可与内皮细胞及白细胞上存在的一个特异性FXa受体-效应器蛋白酶受体-1(effector protease receptor-1，ERP1)结合，促进炎症介质如IL8、IL6、TNF-α等释放[16]；LMWH的非抗凝抗炎机制主要是通过抑制炎症细胞、炎症因子(如TNF-α、白介素等)及黏附分子等发挥抗炎作用；通过降低体内炎症因子水平达到抗炎作用[16-18]。有研究显示血浆TNF-α、IL-6水平增加也可促进GCX的脱落，加重蛋白尿症状[19]，因此抑制二者表达可能也是LMWH发挥肾脏保护作用的机制之一。

综上所述，LMWH可能是通过修复GCX减少蛋白尿的产生[1]，并通过降低血浆TNF-α、IL-6含量减少蛋白尿的产生[20]。这可能是LMWH保护阿霉素NS大鼠肾脏的重要机制之一。