载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的制备及抑瘤作用研究

刘 炜，王晓彤，王建华（.首都医科大学附属北京世纪坛医院药剂科，北京 00038；2.解放军总医院老年医学研究所，北京 00853）

载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的制备及抑瘤作用研究

刘 炜1＊，王晓彤1，王建华2#（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院药剂科，北京 100038；2.解放军总医院老年医学研究所，北京 100853）

目的：制备载阿霉素聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸-聚乙二醇（PLGA-PLL-PEG）纳米粒，并研究其抑瘤作用。方法：应用PLGA-PLL和活化PEG聚合而成的PLGA-PLL-PEG为载体包载阿霉素，制得载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒。检测纳米粒的形态大小、粒径分布、阿霉素的含量，计算载药量和包封率，比较纳米粒和阿霉素在144 h内的累积释放率（Q）和对乳腺癌HeLa细胞的增殖抑制率，计算半数抑制率（IC50）。结果：所制载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒为规则圆形，分散性良好，无黏连，平均粒径为（136.7±9.3）nm（n＝5），平均包封率为（76.67±8.63）%，平均载药量为（3.86±0.55）%（n＝3）；阿霉素的Q12h达100%，载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的Q24h为52.9%、Q144h为81.2%。载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制率较阿霉素增长缓慢，二者的IC50分别为1.844、0.345µg/m L。结论：成功制得载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒，其具有良好的缓释效果，其抑瘤作用强于阿霉素。

阿霉素；聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸；聚乙二醇；纳米粒；肿瘤细胞；抑制

阿霉素是蒽环类抗肿瘤药物，通过干扰转录过程，阻止信使RNA（mRNA）的形成发挥抗肿瘤作用，目前在临床上常用于各种实体肿瘤治疗[1]。传统的抗肿瘤药物给药方法难以使药物浓度聚集在肿瘤局部，因此临床疗效差，而且对全身组织器官的毒副作用显著。本研究旨在应用具有缓控释特点的骨架型高分子材料，通过改变药物剂型来改变药物的释放特点，并应用于局部肿瘤治疗中，使肿瘤局部持续缓慢地形成高浓度药物，以增强抗肿瘤作用，并降低其对机体的毒副作用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一类可生物降解的高分子聚合物，聚赖氨酸（PLL）是具有氨基酸重复单元的多肽，具有带正电的氨基基团，经过PLL修饰后的PLGA纳米粒，能显著增加细胞的摄取率，再通过聚乙二醇（PEG）修饰可以延长纳米粒在体内的循环时间。本研究应用复乳法，以PLGA-PLL和活化的PEG聚合而成的PLGA-PLLPEG为载体包载阿霉素，制成载阿霉素PLGA-PLLPEG纳米粒，并观察其体外释放行为和抗肿瘤作用，旨在为研究抗肿瘤药物的局部应用剂型提供依据。

1 材料

1.1 仪器与透析袋

F-7000荧光分光光度计、JEM-200CX透射电子显微镜（日本日立公司）；Zetasizer-3000激光粒度分布测量仪（英国Malvern公司）；ST16离心机（美国Thermo公司）；伯乐680全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；透析袋（美国MFPI公司，截留分子量：7 000）。

1.2 药品与试剂

阿霉素原料药（大连美仑生物技术有限公司，批号：160219，纯度：99.0%）；PLGA-PLL（美国Sigma公司，批号：16010785，分子量：2 000）；活化PEG（CDI-PEGCDI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：20160317，分子量：2 000）；聚乙烯醇（PVA）、二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、二氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯）；MTT（上海碧云天生物技术研究所，分析纯）。

1.3 细胞

乳腺癌HeLa细胞由中国科学院上海细胞库提供。

2 方法

2.1 PLGA-PLL-PEG的制备

取0.5 g CDI-PEG-CDI，溶于无水DMF中，再加入1.0 g PLGA-PLL，搅拌反应48 h。CDI-PEG-CDI带有活泼的酰基咪唑基团，可以酰胺键与PLGA-PLL的氨基酸基团相连，生成PLGA-PLL-PEG。反应结束后，用透析袋透析上述反应液，共24 h，将透析后的产物真空干燥24 h，得PLGA-PLL-PEG。

2.2 载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的制备

取一定量的PLGA-PLL-PEG溶于2 m L二氯甲烷中，作为油相；取阿霉素溶于聚山梨酯80水溶液（质量浓度为60mg/m L）10m L中，作为水相；将水相逐滴加至油相中，超声形成乳液。将上述乳液加入至50m L PVA水溶液（质量浓度为3mg/m L），搅拌2 h，15 000 r/min（离心半径14 cm）离心30m in，冷冻干燥24 h，得载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒。

2.3 纳米粒的特征

取适量的载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒，用超纯水稀释，滴在载有碳膜的铜网上，应用透射电子显微镜分析纳米粒的形态大小。同样取稀释的纳米粒应用激光粒度分布测量仪分析其粒径分布。

2.4 阿霉素的含量测定

[2]方法，应用荧光分光光度计对阿霉素的含量进行测定，激发波长为485 nm，发射波长590 nm。

2.5 纳米粒的载药量与包封率

取一定量冷冻干燥的载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒粉末，溶于定量DMSO溶液中，稀释至一定浓度，按照“2.4”项下方法测定纳米粒中阿霉素的含量，计算纳米粒的载药量和包封率。载药量（%）＝纳米粒中阿霉素的质量/纳米粒的质量×100%，包封率（%）＝纳米粒中阿霉素的质量/阿霉素的加入质量×100%。

2.6 纳米粒的体外释放试验

精密量取适量的载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒，分散于pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于透析袋中，再将透析袋置于200 m L释放介质（pH 7.4 PBS）中，在37恒温摇床中进行释放试验。分别于2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、120、144 h取样，取样同时补加等量等温释放介质，测定样品中阿霉素含量，计算累积释放率（Q）。另取阿霉素原料药作为对照，按上述方法测定其Q，比较载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒和阿霉素在不同时间点的Q。

2.7 纳米粒的抑瘤作用

调整HeLa细胞密度为2×104个/m L，接种在96孔板上，试验分为阿霉素组和纳米粒组，分别加入阿霉素质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/m L的阿霉素原料药或载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒，每个浓度设5个复孔。作用12、24、48、72、96 h后，移除含药培养基，每孔加入200µL含10%MTT（0.5mg/m L）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM培养基），继续培养4 h后，弃含MTT的培养基，每孔加入200μL的DMSO。用酶标仪测定490 nm波长下的光密度（OD），计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）＝（1－加药孔OD值）/空白对照孔OD值×100%。应用SPSS 18.0软件计算细胞半数抑制浓度（IC50）。

3 结果

3.1 纳米粒的表征

所制载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒为规则圆形，分散性良好，无黏连，平均粒径为（136.7±9.3）nm（n＝5）。载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的透射电镜图见图1，粒径分布见图2。

图1 载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的透射电镜图Fig 1 TEM images of adriam ycin-loaded PLGAPLL-PEG nanoparticles

图2 载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的粒径分布Fig 2 Particle size distribution of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.2 纳米粒的包封率与载药量

所制3批载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的包封率分别为77.6%、74.9%、77.5%，平均值为（76.67± 8.63）%；载药量分别为3.85%、3.78%、3.95%，平均值为（3.86±0.55）%。

3.3 体外释放行为

阿霉素的Q2h为83.6%，Q12h已达100%；载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的Q12h为41.3%，Q24h为52.9%，Q144h为81.2%。结果提示阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒具有缓释作用，可持续释放144 h以上。阿霉素和载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的释放曲线见图3。

图3 阿霉素和载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒的释放曲线Fig 3 Release curves of adriam ycin and adriam ycinloaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles

3.4 抑瘤作用

3.4.1 不同作用时间下的抑瘤作用 在阿霉素质量浓度为0.2µg/m L时，随作用时间延长，阿霉素对HeLa细胞的增殖抑制率增长迅速，作用12 h的增殖抑制率已达56.2%，作用48 h后增殖抑制率逐渐进入平台期，作用96 h的增殖抑制率为96.7%。与阿霉素比较，载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制率随作用时间的延长缓慢增长，作用12 h的增殖抑制率为19.6%，作用96 h的增殖抑制率为73.1%，提示载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒具有缓释作用。阿霉素和载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制率-时间曲线见图4A。

图4 阿霉素和载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制曲线Fig 4 Proliferation inhibition curves of adriam ycin and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleson HeLa cells

3.4.2 不同药物浓度下的抑瘤作用 与阿霉素比较，载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制率增加，阿霉素的IC50为0.345µg/m L，载阿霉素PLGAPLL-PEG纳米粒的IC50为1.844µg/m L，提示载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒比同浓度的阿霉素表现出更强的抑瘤作用。阿霉素和载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对HeLa细胞的增殖抑制率-药物浓度曲线见图4B。

4 讨论

药物缓释系统是将药物负载于可降解或不可降解的载体中，从而降低药物的释放速度。药物的扩散除自身扩散外，还包括通过骨架的生物降解和溶蚀作用、渗透压作用，达到缓释的目的[3-4]。

生物相容性好和生物降解性是缓控释体系载体材料的主要特点，具有良好的生物降解性的高分子材料如明胶、血清蛋白等具有较好的生物相容性[5-6]。明胶作为一种水溶性高分子材料，可作为药物微球或微胶囊化的载体，然而此类载体制备困难、成本较高，因此近年来由于合成类的可生物降解聚合物载体对药物具有缓释作用，故逐渐开发应用于缓控释体系中，如脂肪族聚酯类、聚氨基酸类[7-8]。目前研究最广泛的合成类聚合物载体是聚乳酸及其衍生物，已有研究应用复乳法制备了各种药物的聚乳酸微球[9]。然而聚乳酸具有亲油疏水性，在水溶液中的悬浮性较差，因此常加入带羟基化合物如聚乙二醇单甲醚（mPEG）交联进行改造，mPEG等亲水性物质能调节聚乳酸载体的降解速度[10-11]。PLGA与m PEG交联形成的mPEG-PLGA为两性聚合物，能够转载亲水性药物或疏水性药物[12-13]。本研究应用复乳法制备的载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒，阿霉素的包封率为（76.57±8.63）%，载药量为（3.86±0.55）%（n＝3）。

抗肿瘤药物的缓慢释放，能提高药物的疗效，并降低毒副作用，因此药物的释放速率是考察药物缓释系统的重要指标。本研究结果显示，制备的载阿霉素PLGAPLL-PEG纳米粒Q12h为41.3%，Q24h为52.9%，Q144h为81.2%。这提示24 h内为起始突释期，为药物从载体表面的释放或近表面的药物在几小时内快速释放时期；24 h之后药物的释放共包括两种机制，即聚合物载体的溶蚀和载体孔道的扩散，聚合物载体溶蚀后释放出部分药物，载体溶蚀后或形成孔道，药物从孔道扩散释放，构成体外释放的降解缓释期。

本研究通过比较不同浓度载阿霉素PLGA-PLLPEG纳米粒和阿霉素对HeLa细胞增殖的抑制作用，发现载阿霉素PLGA-PLL-PEG纳米粒对细胞的IC50显著高于阿霉素，说明PLGA-PLL-PEG纳米粒提高了阿霉素对肿瘤细胞增殖的抑制作用，具有更强的抗肿瘤作用。

参考文献

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（编辑：邹丽娟）

Study on Preparation and Antitumor Activity of Adriam ycin-loaded PLGA-PLL-PEG Nanoparticles

LIU Wei1，WANG Xiaotong1，WANG Jianhua2（1.Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China；2.Institute of Geriatrics，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China）

OBJECTIVE：To prepare adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles，and study its antitumor activity.METHODS：PLGA-PLL-PEG w ith the polymerization of PLGA-PLL and activated polyethylene glycol was used as carrier for adriamycin，and adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticleswere prepared.The shape size，particle size distribution，adriamycin content of nanoparticles were detected，drug loading and encapsulation efficiency were calculated.Cumulative release rate（Q）of nanoparticles and adriamycin w ithin 144 h and its proliferation inhibition rate on breast cancer HeLa cells were compared，and half inhibitory rate（IC50）was calculated.RESULTS：Prepared adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles were regular circular w ith good dispersion and no adhesion.The average particle size was（136.7±9.3）nm（n＝5），average encapsulation efficiency was（76.67±8.63）%，average drug loading was（3.86±0.55）%（n＝3）.Q12hof adriamycin had reached 100%；Q12hof adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles was 52.9%，Q144hwas 81.2%.The inhibitory rate of adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles on HeLa cells increased slow ly than adriamycin；IC50were 1.844，0.345µg/m L，respectively.CONCLUSIONS：Adriamycin-loaded PLGA-PLL-PEG nanoparticles are prepared successfully，show ing good sustained-release effect and more significant inhibitory effect than adriamycin.

Adriamycin；PLGA-PLL；PEG；Nanoparticles；Tumor cells；Inhibitory

R943

A

1001-0408（2017）16-2262-04

2016-11-03

2017-02-17）

＊副主任药师，硕士。研究方向：药剂学。电话：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

#通信作者：副研究员，硕士。研究方向：老年医学。电话：010-66876421。E-mail：rambler973@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.16.28