肿瘤微环境在胃癌腹膜转移中的作用及其分子机制研究

朱小坚 朱正明

(南昌大学江西医学院，南昌 330006)

腹膜由覆盖于腹、盆腔壁的壁腹膜与器官表面的脏腹膜构成，其间质包含大量间皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞及少量结缔组织和血管淋巴组织，是全身面积最大、结构最复杂的浆膜。腹膜转移是影响胃癌(Gastric cancer,GC)治疗方式和预后的重要因素。在中国，腹膜转移占GC转移的53%～60%，超过肝转移(40%)和其他转移(3%～7%)；T3/T4期10%～20%已存在腹膜微小转移灶；发生腹膜转移5年生存率仅为2%，中位生存期只有3～6个月[1]。腹膜转移是一系列多步骤进行性发展过程，包括癌细胞脱离原发肿瘤；在腹腔中游离存活；附着于远处腹膜；侵入腹膜下组织并通过新生血管增殖等。腹腔微环境中的多种细胞成分以及相关细胞活性物质为GC腹膜扩散、种植提供了适宜的土壤。本文就腹腔微环境中参与GC腹膜转移的主要细胞成分进行综述。

1 人腹膜间皮细胞(Human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)

1.1腹膜间质中含有丰富的HPMCs，大量研究表明GC腹膜转移与HPMCs密切相关。显微镜下HPMCs呈星状，汇合后呈多边形，直径约为9～15 μm，表面有丰富的微绒毛。HPMCs广义上被归类为上皮细胞，具有上皮细胞的许多特征，例如顶/基极性、基膜黏附、连接复合物。其双重表型特征影响细胞功能，决定它们如何对环境变化做出反应。HPMCs正常形态为鹅卵石样的单层细胞紧密排列在腹膜表面，是阻止微生物、肿瘤细胞侵入的第一道防线[2]。HPMCs在受到外来刺激下细胞骨架发生重构，呈纺锤形，细胞形态学的特征为GC腹膜转移提供了可行性。随着我们对HPMCs生理学知识的深度了解，发现HPMCs作为一种动态细胞兼具其他重要的生理功能。例如HPMCs通过分泌广泛的细胞因子、生长因子和细胞外基质蛋白参与炎症和组织修复[3]；表达Ⅱ类主要组织相容性复合体分子，通过抗原呈递方式调节免疫应答[4]；在受到外来刺激完整性遭到破坏的情况下，通过增强肿瘤细胞黏附、增殖，促进结直肠癌与卵巢癌等恶性肿瘤腹膜转移[5,6]。

1.2侵袭转移是肿瘤细胞在一系列多步骤发展过程中由自身和局部肿瘤微环境双向诱导作用所获得的一种能力。Paget等[7]提出“种子和土壤”理论，即转移只发生在有利于肿瘤细胞生存和生长的环境中。首先，细胞因E-钙黏蛋白(E-cadherin)、膜联蛋白1(Annexin 1)等细胞间黏附分子的表达下降[8,9]以及上调S100钙结合蛋白A4(S100A4)表达，通过改变细胞骨架动力学影响癌细胞运动性[10]，从而促进癌细胞自动脱离进入腹腔，成为腹腔游离癌细胞(Intraperitone free cancer cells，IFCCs)。之后IFCCs克服缺氧微环境得到生存，并在重力、胃肠道蠕动及膈肌运动等产生的压力帮助下扩散并最终种植于远处HPMCs的表面。然而，即使IFCCs成功附着于腹膜后，大多数IFCCs也会因腹膜-血屏障而死亡，只有少数IFCCs可通过穿透作用进入内膜间隙，随后IFCCs在转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)、表皮细胞生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMP)等作用下，诱导间皮细胞收缩，暴露出间皮下基底膜，诱导HPMCs凋亡。

1.3研究表明GC腹膜转移与诱导HPMCs凋亡息息相关。IFCCs黏附于HPMCs后首先透过间皮屏障发生渗透，细胞间相互作用伴随着异型细胞间通讯，其主要由细胞间隙中的质膜连接蛋白介导。Tang等[11]最新发现质膜连接蛋白(Connexin43,Cx43)的高表达充当GC细胞与HPMCs细胞间的信息交流桥梁，这有助于GC细胞黏附于HPMCs。IFCCs成功黏附于HPMCs后进入内膜间隙，诱导HPMCs凋亡，导致HPMCs表面损伤，研究表明创伤间皮表面往往是肿瘤细胞黏附的优选位点。Na等[12]发现GC细胞MKN45的细胞上清液在与腹膜间皮细胞HMrSV5混合培养后，镜下发现HMrSV5出现显著凋亡形态学改变，如染色质固缩、核碎裂以及凋亡小体形成。这些数据表明MKN45上清液可以诱导HPMCs凋亡，且与凋亡相关蛋白(Bax，Bcl-2)的异常表达有关，这可能是肿瘤细胞黏附于间皮下组织的分子机制。另外在HMrSV5上清液中还发现转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表达，其通过诱导HPMCs中胶原蛋白Ⅲ和纤连蛋白的表达，也相应增加了GCC黏附能力[13]。肿瘤细胞来源的TGF-β1作用于HPMCs，刺激诱导产生活化的aHPMCs，其有助于纤维化面积的继续扩大[14]。最新研究发现，TGFβI作为TGF-β诱导HPMCs活化的一种细胞外基质蛋白，其表达可诱导HMrSV5细胞黏附并显著增加其增殖迁移能力[15]。Miao等[16]也证实GCC分泌的TGF-β1以自分泌/旁分泌方式作用于HPMCs，促进了GC腹膜转移的纤维化进程。这些数据表明TGF-β1通过作用于HPMCs，诱导腹膜纤维化，为胃癌的腹膜转移创造了良好的微环境。另外近几年研究热点表明，肿瘤来源的外泌体通过引起HPMCs的损伤破坏间皮屏障并诱导间皮细胞凋亡及上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，还通过诱导间皮细胞黏附分子如纤连蛋白1(Fibronectin1,FN1)、层黏连蛋白γ1(Laminin subunit gamma1,LAMCγ1)表达增加等方式促进GC腹膜转移。

1.4HPMCs的EMT过程是肿瘤侵袭转移的一个中心环节。发生EMT后的HPMCs表面E-cadherin表达水平显著降低，平滑肌肌动蛋白(α Smooth muscle actin,α-SMA)表达水平增加，导致HPMCs细胞骨架重组呈纺锤体形态。发生EMT后的HPMCs失去了原有上皮细胞的特征，分化成肌成纤维细胞，同时也获得能够产生细胞外基质的特征，这些改变导致肿瘤细胞穿越基底膜向邻近组织游走的能力相应增强。其EMT过程主要由TGF-β诱导产生，最新发现结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和胰岛素样生长因子(Insulin like growth factor，IGF-1)作为HPMCs的EMT发生新型有效激活剂，也可促进EMT的发生[17,18]。随着对腹膜转移分子机制的深入研究，在LncRNA、MicroRNA多个层面均可有效地控制或延缓HPMCs的EMT过程，从而抑制GC腹膜转移。综上，HPMCs的EMT发生在GC腹膜转移进程中扮演着至关重要的角色，针对EMT的靶向治疗有望更好地防治GC腹膜转移。

2 肿瘤相关成纤维细胞

2.1肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤基质的重要组成部分。在肿瘤发生发展过程中，CAFs通过一系列功能(包括细胞外基质沉积、血管生成、化疗多药耐药)在肿瘤-基质相互作用中发挥着不可或缺的作用。CAFs呈纺锤形状，α-SMA和成纤维细胞活化蛋白的过表达是其表面主要的特异性标志物。CAFs主要来源于间充质干细胞、EMT化的HPMCs。此外也有研究表明骨髓来源的CAFs通过人基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived faceor-1，SDF-1)/C-X-C趋化因子受体4型(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)系统迁移进入腹腔微环境中并增强肿瘤纤维化[19]。之后CAFs在肿瘤微环境产生的一系列生长因子、炎症因子[TGF-β、胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor,IGF)-1、IL-4]的激活下分化增殖。有研究利用蛋白质组学生物技术发现膜蛋白Caveolin-1(Cav-1)作为激活CAFs的关键调节因子，介导CAFs的活化，从而促进GC纤维化[20]。同样CAFs来源的Asporin通过CD44-Ras相关的C3肉毒底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac 1)途径活化介导的旁分泌作用于CAFs也能促进GC细胞的侵袭迁移[21]。这些研究表明肿瘤微环境中提供的血小板衍生因子(Platelet derived growth factor，PDGF)与MMP等多种活性分子通过复杂的信号通路参与CAFs的活化。因此，针对CAFs纤维化的靶向治疗也能有效控制GC腹膜转移。

2.2激活后的CAFs可分泌大量信号分子并通过复杂信号通路作用于GC细胞，促进其侵袭转移。近年来，研究发现CAFs分泌的IL-6、IL-11、IL-22等因子也促进了GC的侵袭转移进程。例如肿瘤微环境中CAFs分泌的IL-6通过JAK2/STAT3信号通路促进GC的EMT和转移[22]；上调黏蛋白MUC1通过IL-11-STAT3/ERK信号传导途径促进GC进展[23]；分泌IL-22激活STAT3/ERK信号传导途径可促进GC侵袭[24]。另外，CAFs对MicroRNA的表观遗传学改变(DNA甲基化修饰)也可刺激GC腹膜转移。例如，在GC中CAFs通过MiR-200b的表观遗传学改变参与癌旁细胞的进展和侵袭[25]；肿瘤基质CAFs中的MiR-106b通过靶向作用于PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromo-some ten)促进细胞迁移侵袭[26]；CAFs基质中的MiR-143通过TGF-β/SMAD信号通路正向调节Ⅲ型胶原蛋白的表达进而间接促进GC的纤维化进程[27]。目前，CAFs中MicroRNA信号通路的相关研究正成为胃肠肿瘤领域的热点，因此对于CAFs中MicroRNA信号通路功能的研究有望成为GC腹膜转移的治疗新靶点。激活后的CAFs可分泌大量相关小分子蛋白(受体蛋白、配体蛋白、细胞外基质蛋白等)，介导CAFs与肿瘤细胞间的信息交流。CAFs分泌的一些细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)蛋白也在促进GC转移中起重要作用，例如Lumican、POSTN等。Lumican在GC CAFs中高表达，其由CAFs分泌到GC的微环境中，通过激活整合素β1-FAK信号通路来促进GC细胞增殖、迁移和侵袭[28]。糖结合蛋白(Galectin，Gal)-1是一种在CAFs中过表达的碳水化合物结合蛋白，由CAFs分泌并通过上调整合素β1促进细胞增殖。POSTN是由CAFs分泌的一种ECM蛋白，并通过激活ERK途径参与上皮细胞的黏附和迁移[29]。体外研究进一步证明，GC细胞与表达POSTN的CAFs共培养促进肿瘤形成[30]。因此，CAFs分泌的ECM蛋白为GC侵袭转移提供了良好的微环境。此外，包括生长因子、趋化因子、膜蛋白在内的多种分子也在CAFs中高度表达，他们均可促进GC的发生发展。这些研究表明，CAFs作为基质细胞的重要组分可分泌许多分子进一步促进肿瘤发展。

2.3外泌体是一些包含功能性生物分子的小膜囊泡，大小30～200 nm不等。最近的研究表明，CAFs除自身直接参与GC转移的纤维化过程外，CAFs来源的外泌体可能与肿瘤微环境的形成有关，如转移性生态、血管生成。外泌体具有与其起源相关的特定组成，不仅可转移膜成分，而且可转移异型细胞之间的核酸，表明外泌体在细胞间通讯中发挥着复杂的作用。在Gu等[31]一项研究中，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)在暴露于GC细胞来源的外泌体中培养后获得了CAFs表型，并且MSCs向CAFs分化与TGF-β/Smad信号通路的活化相关，分化后的CAFs促使肿瘤微环境向有利于GC发生的方向发展。最近Miki等[32]也发现，通过将硬皮型GC细胞系(OCUM-12、NUGC-3)与CAFs来源的外泌体共培养，发现源自CAFs且表达CD9+(外泌体表面标志物)的外泌体显著刺激OCUM-12和NUGC-3细胞的侵袭和迁移，其分子机制可能与细胞外MMP活化、β1整合素的过表达有关。以上研究均表明CAFs来源的外泌体参与了肿瘤微环境的形成，直接或间接促进GC的增殖和侵袭，提示CAFs可作为GC治疗的新靶点。

3 免疫细胞

3.1肿瘤相关巨噬细胞 慢性炎症在恶性肿瘤的形成过程中起重要调节作用，肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)在这一过程中发挥关键作用。巨噬细胞分为两种主要表型：M1和M2。M1型特征在于释放炎性细胞因子、活性氮、氧中间体，具有杀伤病原体、肿瘤细胞活性。相反，M2型被诸如IL-4、IL-13和IL-10等抗炎分子、凋亡细胞和免疫复合物表达免疫抑制表型，其可缓解炎性反应，清除细胞碎片，促进血管生成和组织重构[33]。但至今在GC腹膜扩散患者中，大量TAMs主要表现M2型。TAMs主要通过CCL2-CCR2轴将血液中单核细胞募集于肿瘤细胞周围，之后在肿瘤微环境中的生长因子、细胞因子作用下极化为M2型。Takahisa等[34]在研究GC腹膜扩散的过程中发现，GC细胞MKN45与M2型巨噬细胞共培养时，M2型TAMs数量增多，M2相关信使RNA(IL-10、血管内皮生长因子A/C等)也都表达增加，最终导致肿瘤的加速生长，其具体的调控机制可能与激活EGFR信号通路有关。TAMs调节GC侵袭和转移的方式也呈多样化，例如通过作用于TGF-β与骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)促进转移；TAMs来源外泌体通过NF-κB途径促进侵袭；TAMs迁徙抑制因子通过活化PI3K/Akt 抑制GC转移。这些研究表明TAMs在GC腹膜转移的过程中具有复杂的调节作用，其调节分子机制的阐明对于GC的靶向治疗具有极其重要的意义。

血管、淋巴管生成是肿瘤转移不可或缺的一步，TAMs被认为在肿瘤组织血管、淋巴管生成过程中起到了重要的支持作用。在Wu等[35]对TAMs数量与GC临床特征的分析研究中发现，TAMs与浆膜浸润、淋巴结转移和TNM分期之间存在显著相关性，提示TAMs累积可能与GC进展有关。进一步的研究发现TAMs数量与GC中的微血管密度和淋巴管密度有关，表明TAMs可能参与GC中的血管、淋巴管生成。肿瘤组织血管、淋巴管生成过程是肿瘤细胞与间质组分之间一系列相互作用的结果，特别是TAMs等免疫细胞的维持作用。据报道，缺氧环境在肿瘤血管的生成中发挥显著作用。Shen等[36,37]通过对比缺氧与正常生理条件下TAMs对肿瘤细胞迁移能力及与肿瘤侵袭、转移有关的基因[包括去整合素金属蛋白酶(A disintegrin and metallopro-tease，ADAM)8/9、MMP9、金属蛋白酶组织抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)3等]表达的影响，发现ADAM8/9高表达，MMP9、TIMP3低表达。另外在缺氧肿瘤微环境中IL-10、IL-11、IL-18在CD14+TAMs中表达也各不同。这些数据提示我们TAMs、缺氧环境在体外调节GC细胞侵袭时起着不可或缺的作用。有研究结果表明，在微环境中肿瘤细胞与TAMs之间的相互作用通过转录因子NF-κB的激活调节VEGF和VEGF-C表达进而影响血管、淋巴管生成的过程。这提示我们TAMs参与GC血管、淋巴管生成的过程是治疗GC腹膜转移的有效新靶点。Shen等[36,37]后续实验也证实了这一观点，发现Vasohibin-1、Vasohibin-2在GC细胞和TAMs中显著低表达，其表达水平受TAMs和缺氧的调节，且在每个胃细胞系中表达有差异。Vasohibin-1、Vasohibin-2不仅可作为内皮细胞产生的内源性血管生成抑制剂，还能作为其他细胞分泌的外源因子在血管生成调节中发挥重要作用，因此Vasohibin-1、Vasohibin-2作为血管生成抑制剂可能是治疗GC的潜在靶点[38]。

最近在巨噬细胞介导GC的迁移和侵袭的研究中发现凝血因子也能刺激巨噬细胞向M2表型TAMs分化。Ma等[39]发现M2表型TAMs在凝血因子VIIa、凝血因子XIIa的激活下分泌大量与肿瘤转移相关的细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β、TNF-α，进而诱导GC细胞的迁移和侵袭。在探寻GC细胞迁移和侵袭的分子机制中发现其可能与介导VEGF/MMP-9的表达有关。此外，包括细胞因子、趋化因子、细胞外基质蛋白在内的多种分子也在TAMs中高度表达，并刺激GC侵袭。这些包括细胞因子IL-10、IL-11、IL-18、长链蛋白P115和细胞外基质蛋白骨桥素(Osteopontin,OPN)。这些研究表明，活化的TAMs可进一步表达促进GC发展的分子，为GC的腹膜转移提供有利的腹腔微环境。

3.2调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs) Tregs是一类具有免疫调节功能的T淋巴细胞，可抑制效应T细胞活化增殖而导致免疫功能紊乱。近年来，肿瘤内Tregs特别是其亚型被认为在肿瘤免疫逃逸中起关键作用，Tregs与GC预后不良息息相关。FoxP3+Tregs是最受关注的Tregs亚型，在肿瘤微环境中具有复杂的调节作用。在Yuan等[40]的一项研究中，FoxP3+Tregs在胃肿瘤中高表达，分析发现高密度的FoxP3+Tregs与肿瘤TNM分期有关。肿瘤浸润性Tregs中FoxP3的表达增加可以通过环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)2/聚乙二醇轴在肿瘤微环境中介导免疫抑制，较高水平的FoxP3+Treg细胞能够抑制自体CD4+CD25-T细胞的增殖。因此这给我们提供了一个治疗GC的新思路，通过调节Tregs活性来减弱肿瘤免疫逃逸作用。有趣的是，Tregs的调节作用不仅与细胞亚型有关，还和细胞间距有联系。Feichtenbeiner等[41]首次研究CD8+与FoxP3+肿瘤浸润T淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)的同时空间分布模式及其对GC预后影响中发现，TILs影响预后的关键取决于细胞间距。FoxP3+TILs必须位于与CD8+TILs细胞30～110 μm之间的距离内，才会对预后产生积极影响。Kim等[42]也证实了肿瘤内CD8+和FoxP3+TILs高密度表达与预后良好相关，提示这两个亚型的TILs协同作用可作为GC的独立预后因素。新发现的CD45RA-CCR7-效应/记忆表型Tregs亚型构成了大多数肿瘤浸润性Tregs。GC中该亚型表达丰富，且与疾病进展和术后患者的生存率呈负相关。其抑制免疫反应的分子机制可能是肿瘤来源的TNF-α通过诱导信号转导和转录激活因子STAT3磷酸化，有效诱导CD45RA-CCR7-Treg亚型并抑制这些细胞上的人类白细胞的DR抗原表达。反过来，CD45RA-CCR7-Treg亚型通过IL-10分泌和细胞间接触而抑制CD8+T细胞抗肿瘤反应，进而有助于肿瘤逃脱免疫抑制[43]。总之Tregs的亚型种类、数量、分布都与GC侵袭和转移过程密切相关，通过调节Tregs的联合免疫治疗方式可能会改善GC治疗效果。

4 结语与展望

腹腔微环境含有丰富的细胞成分并处于大量的活性分子包绕之中，随着肿瘤细胞从原位脱离进入腹腔形成IFCCs并在腹腔种植，肿瘤微环境就向着有利于GC进展的方向发展。由于腹腔内的多种细胞成分及其表达的相关活性物质提供的适宜土壤，从而促进了GC的腹膜转移过程。因此，从腹腔微环境中的这些细胞成分与GC细胞的相互作用过程中能更好地了解GC腹膜扩散形成的分子机制，有助于开发针对每一步GC腹膜转移的新干预措施和分子靶向治疗，使GC靶向治疗迈上一个新台阶。