生鲜乳中微生物检测技术研究进展

赵艳坤，陈贺，王帅，王富兰，蔡建星，王成

（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐），新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐 830091）

随着人们对高水平生活的向往和追求，乳品的需求量不断增加，人们对乳品的关注不止在于其丰富的营养价值，更倾向于乳品质量安全问题。生鲜乳作为乳制品的源头，其全价的营养成分为微生物提供了理想的生长繁殖条件，有害微生物的污染成了优质生鲜乳的最大危害，这不仅影响乳品质量安全，也关乎着整体乳业的健康发展。因此，对生鲜乳中微生物进行安全、高效、便捷的检测对奶业绿色发展及人类健康具有重要意义。

1 微生物学检测技术现状

多年来，多数企业、乳品产商及质检部门采用传统方法检测乳品中微生物，主要对普通活菌总数进行测定，包括标准平板计数（Standard plate count method，SPC）和显微镜直接观察（Direct microscopic observation，DMC）两种方法。传统检测方法虽具有所需设备简单易操作和低成本的优点，但多依赖操作人员的主观判断能力，并不能完全鉴定出乳品中某些细菌[1]，数据的可靠性及结论的正确性难以保证，且操作过程繁琐、周期长、费时费力，无法满足大批量检测和处理突发事件的需要。为实现快速检测目的，有研究者建立了皿膜系统、疏水网格滤膜（Hydrophobic grid mesh filter，HGMF）法、螺旋板系统等，这些优化的检测方法均一定程度上提高了操作效率，尤其是HGMF法能滤去样品中的抑制因子，使其在转移过程中不需进行悬浮处理，避免了菌体受到物理破坏，可对沙门氏菌、大肠菌群、霉菌及酵母菌计数，在生鲜乳和巴氏杀菌乳的质量管理中被广泛应用[2]。

2 物理生化技术

2.1 电阻抗法

微生物在培养基中生长繁殖时，可将培养基中的碳水化合物、蛋白质、糖、脂肪等营养物质新陈代谢为氨基酸、乳酸等小分子物质，这个过程使培养基的导电性能增强而电阻抗性降低，因此可通过测定培养前后培养基的电阻抗变化情况来判定微生物数量和生长等[3]。目前，电阻抗法在食品微生物快速检测中已较为普遍，但在生鲜乳中的应用研究还较少。Bancalari等[4]利用电阻抗法测量电导率变化来追踪牛奶中微生物的生长情况，结果显示阻抗的拟合曲线与细菌生长曲线高度一致，说明电阻抗法完全适用于牛奶中微生物的检测。国内早有学者证明了电阻抗方法检测牛奶中细菌总数的可行性，较传统检测方法，可大大缩短检测周期。近年来，杜寒春等[5]建立了电阻抗法快速测定牛乳中菌落总数的方法，检测限为101～107cfu/mL，得到的阻抗检测时间与菌落总数的标准曲线方程为y=-0.5923t+9.4172，相关系数r=-0.9907，可信度高。

与直接滴定（GB）法相比，电阻抗法简便易操作、耗时短、结果准确可靠，且适用于不同时期、不同来源、不同酸度的产品，实用性更强，但其灵敏度易受样品菌落总数浓度影响，检测时间和检测限不一定精准。另外，由于国内阻抗仪器质量尚有待改进，其成本偏高，该方法目前尚未普及于生鲜乳中微生物检测的应用。

2.2 快速测试片法

快速测试片法是指以纸片、纸膜和胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长特征和显色反应来测定乳品中微生物的方法[6]。研究报道，一种适用于检测乳品中大肠杆菌的快速试纸片，最低检出限达到4cfu/mL，检测结果与GB法相比符合率高于96%[7]。美国3M公司研发的Petrifilm测试片是一种商品化较成熟的菌落测试片，因其自身配有培养基，待测样品则不需增菌，准确性高，在乳品微生物现场检测中具有很大优势，且能够区分大肠菌群中的大肠杆菌和其他成员[8]。梁春梅等[9]使用快速测试片法对生鲜乳、酸奶、纯牛奶等样品进行菌落总数测定，结果发现快速测试片的准确性、特异性、灵敏度、稳定性等各项指标与国标方法（GB4789.2-2010）检测结果差异不显著，具有高度一致性，可提高乳制品中菌落总数的检测效率。

该检测方法简便易行，费用低，适合现场采样检测，可在短时间内迅速对样品进行初筛，但由于空间有限，会因受细菌代谢产物的影响和待测样品中复杂成分的干扰，使菌落之间相互粘连，导致计数不准。

2.3 三磷酸腺苷（ATP）生物发光技术

ATP浓度能够反映存在的活体微生物数量[10]。Niksic等[11]将该法与GB法进行比较，证明了二者具有高度相关性。在国外，ATP技术已经广泛应用于乳品工业，如生鲜乳活菌数检测、UHT乳活菌数检测等[12]。国内学者也对此技术有了较成熟的探究，如：陆烨等[13]通过ATP生物荧光技术快速测定细菌总数的实验，发现大肠杆菌等三种细菌的检出菌数对数值与ATP值的对数值之间呈线性关系，相关系数R2=0.961；王慧荣等[14]采用改进的ATP生物发光技术快速测定活菌量，结果表明ATP检测限为0.001nM，活菌ATP浓度与平板计数的菌落总数结果差异不显著，具有一定线性相关性。虽然此方法有操作简单、检测快速、范围广、携带方便、可在线检测、检出率高等优点，但仍存在不能分辨非微生物中含有的ATP缺陷，会因生鲜乳等新鲜样品中含有大量游离ATP和体细胞而导致检出限较低，同时易受盐等成分的干扰。

3 免疫学技术

3.1 酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA的基本原理是将抗原或抗体作为试剂用酶进行标记，将其固定于固相载体表面，保持其免疫原性，在载体上将酶染色后通过酶催化底物使其生成有颜色的产物，产物的量与样品中待检物质的量成一定比例，通过测量产物的量对待检样进行定性和定量。ELISA能够实现大批量样品的同时检测（96孔），检测限一般在105cfu/mL。王文彬[15]报道称对于食源性致病菌等大分子的微生物，一般采用双抗体夹心ELISA进行检测，灵敏度高且检测数据可靠。国外对食源性致病菌免疫检测方法的研究已较为成熟，其中ELISA检测方法受到广泛关注。最新研究发现，通过建立一种高灵敏度、特异性的ELISA系统，能够用于检测牛奶、肉类和大米中的金黄色葡萄球菌，得出ELISA可用于微生物菌群的免疫检测的结论[16]；Arenas等[17]利用ELISA对16家采用不同抗生素的畜牧场奶牛中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌造成的食物污染进行了检测，结果发现有75%的农场受到这些食源性致病菌的污染。

综上，ELISA用于检测乳制品等各种样品中食源性致病菌的通用性较好，在保证检测准确性的前提下，与其他方法相比，ELISA具有方便快捷、低成本的优点，但抗体的特异性、抗原与抗体的浓度和反应液会影响检测结果，当检测污染较严重的样品时，会受到其他细菌的影响而降低其检测特异性。因此，此方法适用于企业、基层检验机构等有关食品中食源性致病菌的检测。

3.2 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IFT）

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IFT）也称荧光抗体技术，主要原理是用荧光素标记抗体，然后与待检样品中的抗体特异性结合，产生的荧光强度与待测物质的浓度呈线性关系，根据计算得到待测样品含量。IFT作为一种新型检测技术，除用于检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等食品致病菌，还可被用于沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特氏菌等多种致病菌的检测[6]。虽然IFT检测时间短、效率高、灵敏度高，但是抗体价格较贵，成本高，技术性程序较复杂，易发生交叉感染，出现假阳性，难以进行大规模普及使用，目前，IFT在乳制品行业的应用报道较少，有待进一步探究。

4 分子生物学技术

4.1 PCR技术

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是能使微生物在体外迅速扩增特异目标基因的一种技术。此技术无需培养，直接取样检测，快速、灵敏，可以大大缩短检测时间，尤其是对于食品中存在较少且规定不得检出的致病菌具有独特的优势，已广泛应用于食品、医药、环境监测等领域的微生物监测。由于其可以将低浓度微生物进行大量扩增，因此增加了微量浓度微生物被检出的可能性，但是检测之前需要知道待检微生物的核酸序列，对于未知核酸序列的微生物较为局限，定量检测能力稍差，如果和荧光定量相结合则较完美。闫晗等[18]建立了多重PCR检测方法，实现了对乳品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的同时检测，较国标方法缩短了12～24h。研究表明，荧光定量PCR技术不仅可以检测出多种细菌，且能准确鉴定出它们的种和亚种间的基因序列，以此为辨别它们的亲缘关系[19]。刘艳艳[18]采用荧光定量PCR法对500份鲜乳样品中细菌总数进行检测，实现了对生鲜乳中污染细菌种类的鉴定，并建立了污染细菌谱，进一步对100份生鲜乳样品同时运用国标法和荧光定量PCR法检测，验证了PCR法检测细菌的准确性在90%以上，检测时间在4 h左右，得出结论：荧光定量PCR是一种快速检测鲜乳细菌总数的新方法，能够为生鲜乳样品的质量等级进行快速的确定。Sartori报道指出美国乳品科学协会最新开发了一种对牛奶样品中金黄色葡萄球菌的实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测方法，发现RT-qPCR能够快速检测出靶细菌，相比于国标法，检测特异性敏感性为100%，且能够准确排除其他基因型和细菌种类，排他性达98%，揭示了RT-qPCR作为一种检测微生物的新途径，能够简单明了对目的细菌进行检测，非常适用于乳品等各种样品的常规微生物检测[20]。

4.2 核酸杂交技术

核酸杂交技术是在碱基配对的基础上使用核苷酸探针与靶基因特异性进行生物测定的一种标准技术，通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从庞大的基因组中显示出目的基因是一段带有检测标记，且有顺序已知的与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA）[21]。

核酸杂交技术中使用较广泛的是荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH），FISH通过荧光素标记探针并进行杂交，对杂交点进行荧光强度的测定便可得到特定核苷酸序列及其含量。Barrero等[22]利用FISH技术对大肠杆菌基因进行特异性检测，结果不到6h，其靶基因和rRNA基因即被检测出，充分显示了其检测效率。核酸杂交技术正是由于荧光物质的使用提高了分辨率，确保了足够的灵敏度和特异性，操作简便，能够快速检测出待测样品中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等微生物的成分及含量，但遗憾的是每检测一种微生物就需要一种探针，成本较高，难以对待测样品中多种污染菌实现一次性或连续性检测，应用范围有限。

4.3 基因芯片技术

近年来，基因芯片技术是发展迅速的一项高新技术，现阶段在各个领域被各国学者高度重视，成为时下研究热点，已有大量研究工作及成果，但仍有部分问题需进一步探讨。基因芯片技术是将设计好的基因片段或寡核苷酸单链序列固定于芯片上，形成二维DNA探针阵列，待检微生物DNA经过PCR扩增后形成荧光标记分子，再与芯片上的寡核苷酸点进行杂交，然后通过荧光波长扫描仪定量分析待检样品中是否含有目标微生物及其含量。目前，已广泛应用于各种食品微生物检测。最新研究报道称，基因芯片还可用于测定乳品中药物残留。基因芯片技术具有速度快、精准度高的优点，能够检出待测样品中可能存在的多种微生物成分和致病菌，甚至可识别死菌的DNA，但此方法需一定专业技术且难度较大，目前在我国乳品安全检测技术中尚未形成一定的应用规模。

4.4 流式细胞仪

流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是以激光做为光源，通过检测光散射信号和荧光信号强度，推测出微生物的大小、形状和数量。FCM曾在第二次世界大战中用于细菌和孢子的检测，随着仪器光学系统的改进及新荧光素的发现，近年来，FCM在微生物学的应用发展迅速。研究报道，FCM能够鉴定食品中微生物的活性，可快速鉴别并计算死/活细胞数目，由此可以评价食品的杀菌效果及有益菌的含量[23]。有研究证实，FCM可检测生鲜乳等食品中致病菌含量，且FCM计数的检测时间仅为1h[24]，能够满足批量样品在线检测需求，较平板计数法大大缩短了检测用时，此外，FCM的灵敏度更高、更准确。近期，国外研究者发现FCM技术可用于金黄色葡萄球菌等致病菌的检测，为某些疾病的诊断提供一种快速有效的检测方法[25]。杨莉婷等[26]建立了FCM快速检测并计算生鲜乳中细菌总数的方法，与国标检测方法相比，相关性分析显示两者呈直线相关（r=0.9802），极显著相关（P＜0.01），检出限为101cfu/mL，证明了FCM技术具有更高的准确性和灵敏度；另外，Langerhuus等[27]利用FCM技术对乳房炎乳中革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行检测，结果发现FCM可快速识别乳样中的革兰氏阴性菌，灵敏度为1，特异性为0.74，为由革兰氏阴性菌引起的乳房炎抗菌治疗提供了一种新途径。然而，FCM仍有一些弊端，如使用成本过高，只能检测液态样品，且由于对待测液体样品有比较严格的要求，任何与目标物粒径相近的微粒都可能影响检测结果，而生鲜乳中的蛋白质颗粒、脂肪球、体细胞等成分会干扰FCM对目标物的筛选及确认，因此，FCM技术在生鲜乳微生物检测方面的主要问题是清除这三种干扰成分。

5 展望

随着现阶段乳制品工业的迅速发展及乳品质量安全意识的普遍提高，传统的微生物检测方法已不能满足需求，在现代发达的科学技术基础上，建立和完善安全、高效的微生物检测方法对确保生鲜乳质量安全及促进乳品工业科技进步具有重大意义。综上所述，近年来国内外开发了多种微生物安全检测技术方法，今后在乳品业有着非常广阔的应用前景。总体分析可知，这些方法相比于传统方法，虽解决了检测时间问题，但在检测敏感性、特异性及操作等方面各有利弊，因此为了提高生鲜乳微生物检测率，确保乳品质量安全，现实检测过程中常将多种方法结合使用。此外，不难发现，这些新型检测技术的成本较高，这也是其不能成为各机构和基层实验室普遍使用的检测方法的重要原因之一，但是生鲜乳的质量关乎着乳品安全，与消费者的健康和生命安全息息相关，所以，笔者呼吁我国乳品安全检测相关部门有必要加强对生鲜乳微生物安全检测技术的投入力度，为乳品安全创造一个良好的环境氛围。同时，为了能真正实现准确性好、灵敏度高、低成本和快速的微生物智能检测，我们仍需不断克服实际应用中遇到的困难和挑战，加强研究力度和深度。