黏膜免疫及其在猪病防控中的应用

李天芝，于新友，沈志强，2

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

约有80%以上病原微生物主要经过呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途径侵入动物机体引起感染[1]。黏膜是防御病原微生物的第一道屏障[2]，它可在病原微生物侵入机体前将其消灭，免其对机体造成损伤，在疾病的发生和发展中起着重要的作用。黏膜免疫系统是由广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜下及一些外分泌腺体（唾液腺、泪腺、乳腺）处的淋巴组织组成的系统，主要包括3部分：1）黏膜相关淋巴组织，如肠黏膜相关淋巴组织、支气管黏膜相关淋巴组织、泌尿生殖道黏膜相关淋巴组织、鼻咽黏膜相关性淋巴组织和眼结膜相关淋巴组织等[3]；2）致敏淋巴细胞散布途径，主要是淋巴循环及血液循环；3）黏膜免疫效应部位，即全身的黏膜组织，包括胃肠道、呼吸道、眼结膜、生殖道和多种分泌腺如乳腺、唾液腺、泪腺等组织。黏膜免疫是猪体免疫网络的重要组成部分[4]，50%以上的淋巴组织和 80% 的免疫细胞存在于黏膜，黏膜是猪最大的免疫系统。黏膜免疫自发现以来就受到国内外学者的广泛关注，成为研究的热点，黏膜免疫系统与传统意义上的免疫系统不同，不仅能在黏膜局部发挥免疫功能，产生分泌型抗体，阻止了病原微生物从黏膜的入侵，还能通过“共同黏膜免疫系统”使整个机体黏膜系统产生免疫保护[5]，同时又能诱发全身性的体液免疫应答[6]。黏膜局部的抗体比血清抗体出现得早、效价高，且维持的时间长，其抗体水平更能体现疫苗免疫保护情况。黏膜免疫产生的抗体主要以分泌型的IgA（sIgA）为主，还有分泌型的IgM（sIgM）、IgG等。随着集约化、规模化养殖业的不断发展，传统的疫苗注射免疫接种因存在费时费力、对猪的应激大、操作繁琐、容易导致交叉污染等问题，已经不能完全适应生产的需要。黏膜免疫可通过气雾、口服等途径接种，简单易行、副作用较小，更重要的是可阻止病原在局部黏膜的定植，免疫效果好，不仅诱导局部免疫应答，也诱导全身性应答等，因此越来越受到关注。文章主要介绍黏膜免疫及其在猪病防控中的应用。

1 黏膜免疫抗体

1.1 黏膜sIgA

sIgA抗体是由浆细胞分化产生的，在黏膜中含量最为丰富，是参与黏膜免疫反应的主要抗体。sIgA由两个IgA单体、1条J链和一条分 泌 片 (secretory component，SC)构成[7]，J链是在浆细胞分泌IgA前同IgA聚合的，SC则是由IgA穿过上皮转运过程中加上的。SC无免疫活性，但它能促进上皮细胞积极地从组织中吸收sIgA，并将其释放到消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜表面，从而发挥黏膜免疫效应，还能够保护抗体免受蛋白酶的降解，增加抗体的稳定性，使其在消化道及呼吸道管腔中保持活性的时间延长。与单体IgA相比，sIgA表面具有大量的抗原结合位点，结合抗原的能力强。sIgA没有活化补体和其他促炎症因子的功能，当发挥免疫活性时只是与肠腔中的各种抗原连接，干扰它们的摄入，因此对黏膜上皮细胞的损伤较小。sIgA的作用主要是：1）能捕捉进入黏膜内的病原，使病原发生凝聚，阻断其病原与黏膜结合、或与病原微生物结合形成复合物，从而阻断或阻止病原对黏膜的黏附，发挥外源病原的免疫排斥作用；2）能与溶菌酶、补体共同作用引起细菌溶解，也能中和相应肠毒素的毒性；3）能与吞噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等细胞表面的Fc受体结合，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效应，杀伤靶细胞；4）增强乳铁传递蛋白及乳过氧化物酶系统对几种黏膜病原体的抗菌作用；5）可通过黏膜淋巴组织增强抗原依赖性细胞作用，从而提高对病原的直接杀伤能力。

1.2 黏膜 sIgM

sIgM是由5个IgM单体聚合而成，也是能发挥黏膜免疫功能的一种高效抗体。同sIgA的功能类似，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，尤其对IgA免疫缺陷的个体，sIgM的免疫功能更为重要。

1.3 黏膜中的IgG

目前，尚不清楚血清中的IgG是如何进入分泌物中的，黏膜表面的IgG抗体在抵抗感染中可发挥重要作用。分泌到管腔中的IgG同样具有抗菌、抗病毒及抗毒素等功能。但IgG与抗原结合发挥免疫活性时，能激活补体造成黏膜上皮细胞的损伤，从而达到清除病原的作用。IgG抗体对蛋白酶的水解作用抵抗力弱，容易降解，不稳定。IgG同sIgA一样也能发挥ADCC效应，杀伤靶细胞。管腔中的IgG可与抗原结合，形成免疫复合物，返回到黏膜固有层，经树突状细胞处理后，递呈给CD4+ T细胞，以供机体免疫系统识别。

2 黏膜免疫佐剂

经黏膜免疫时大多数蛋白质抗原免疫力降低，经反复大量免疫后，易引起免疫耐受，阻碍了黏膜疫苗的发展。因此，需要配合相应的佐剂，以增强黏膜免疫反应的效果，或使抗原物质免于被胃肠道消化酶降解。黏膜免疫相关佐剂可提高疫苗的免疫原性，延长抗原与黏膜及免疫活性细胞的作用时间，减少黏膜免疫耐受，增强疫苗免疫效果[8]，是黏膜疫苗研发的重点。好的黏膜免疫佐剂需具备以下条件：1）能诱导机体产生强烈的体液和/或细胞免疫应答反应；2）安全性好，无致热原，无致癌致畸特性，无毒副作用，不会引起动物体的过敏反应；3）稳定性好，在一定温度、pH范围能长时间保存，性质不发生改变。目前，人们已开发出多种黏膜免疫佐剂并投入到实际生产中，取得了一定的成果。

2.1 细菌毒素

主要包括从霍乱弧菌获得的霍乱毒素（CT）、从大肠杆菌获得的热不稳定毒素（LT）及从百日咳博德特氏菌获得的百日咳毒素等。其中，CT和LT是公认的有效的黏膜佐剂，均能提高APCs递呈抗原的能力，具有良好的免疫原性。CT和LT均是由A、B两种亚单位组成的六聚体蛋白，A亚单位具有催化ADP核糖基化的作用，B亚单位可与宿主细胞表面受体结合，穿透细胞，将A亚单位带入细胞。CT能诱导CD4+、Th2型细胞活化，产生IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，也能促进IgG2b亚类、IgE和黏膜sIgA应答的出现。与抗原同时口服时可诱导CD4+、Th1细胞产生血清IgM、IgG1、IgG2a和 黏 膜 sIgA。LT作为佐剂可与多种抗原经不同途径共免疫，均能明显增强机体对共免抗原的黏膜sIgA和IgG应答，与CT主要诱导Th2型免疫应答不同，LT诱导的应答要均衡些，产生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜sIgA，是Th1和Th2型应答的混合。CT和LT均具有毒性，LT的毒性较CT低，经黏膜免疫时可产生针对自身的sIgA和血清抗体，限制了其在人体上的应用。

2.2 细胞因子

细胞因子通过促进免疫活性细胞的分化增殖或影响细胞内生物活性分子的表达与分泌而发挥免疫调节作用，可直接作为佐剂使用。目前，常用的细胞因子佐剂有IL-1、IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18 及 GM-CSF 等。IL-1和IL-12不仅能诱导抗原特异性的免疫应答，而且能诱导黏膜免疫应答。IL-1能显著增加抗体水平，尤其是IgG2a和IgA的水平，在鼻内免疫佐剂中可代替CT或LT，毒性相对较小。IL-18可诱导Th1细胞分化发育和增殖。细胞因子佐剂的缺点是半衰期短，活性易受内环境如pH、各种水解酶及血浆蛋白的影响，当剂量大时可导致发热、炎症等副作用。

2.3 CpG基序

通过人工合成的一个或多个非甲基化的CpG基序为核心的寡核苷酸（ODN），也具有相似的免疫刺激功能，可诱导机体产生强烈的体液和细胞介导的全身免疫及黏膜免疫。当与蛋白抗原共同使用时，可诱导机体细胞免疫应答反应。CpG能刺激B细胞增殖，分泌多克隆抗体、IL-6、IL-12[9]，同时激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，促使未成熟的树突状细胞（DCs）转变为成熟的APCs。CpG作为佐剂与抗原共同免疫动物可诱发强烈的以IgG2a和CTL为主的Th1型免疫应答。还能激活T细胞、B细胞、NK细胞等，产生大量的多种细胞因子，增强机体的特异性和非特异性免疫效应。还可与传统的黏膜免疫佐剂CT和LT产生协同效应，且无毒副作用，是一种极具应用前景的黏膜免疫佐剂。

2.4 甘露聚糖

甘露聚糖可作为黏膜反应佐剂，诱导血清、阴道及唾液中sIgA的分泌。

2.5 脂质体

脂质体是由单层或多层磷脂组成的具有水相内核的环形囊状结构小体，对蛋白质或多糖抗原都有免疫增强作用，能激发细胞免疫活性，提高抗体效价，而且抗体滴度维持的时间较长。脂质体与抗原结合后可增加黏膜供给疫苗的有效性，发挥免疫佐剂效应，能诱发高水平的系统IgG和黏膜sIgA抗体反应。作为鼻黏膜免疫佐剂时，刺激机体产生黏膜和全身免疫应答反应。在酸性溶液、胆汁和胰液素中非常稳定，因此，很适合作为口服疫苗的载体，脂质体也可以配合其他黏膜佐剂如CT一起使用，增加口服释放的效率。

2.6 细菌载体

应用化学或分子生物学技术使上细菌中的致病基因发生突变以降低其毒性，但仍保留了其对黏膜的侵袭力或从动物体内分离的益生菌作为载体，将疫苗抗原运载至APCs。目前常用的细菌载体主要包括李斯特杆菌、鼠伤寒杆菌、志贺氏菌、乳酸杆菌、酵母菌等。一般通过口服方式进行免疫，可保护抗原免于被体内酸性环境破坏。

3 黏膜免疫的途径

常见的黏膜免疫途径包括消化道、呼吸道、生殖道、直肠黏膜等。由于每个部位的组织结构各不相同，其免疫的分子机制和效果也不同。疫苗用量较少，又能引起强烈的全身性免疫应答反应的途径是最佳的途径[10]。下面简单介绍一下各种黏膜免疫途径的特点。

3.1 消化道

消化道免疫主要是通过口服疫苗的方式免疫，操作方便，能同时预防肠道及呼吸道、泌尿生殖道感染，是传统的黏膜免疫途径，能产生大量的sIgA发挥免疫功能，但通过消化道免疫疫苗时，疫苗容易被强烈的胃酸环境破坏，免疫时需要加大剂量，或采用特殊的物质包被，以减少胃酸对疫苗的破坏。除了sIgA发挥重要作用外，位于小肠黏膜上皮之间的上皮内淋巴细胞，直接与进入肠腔的微生物接触，也在消化道黏膜免疫中发挥重要的作用。肠道是诱导黏膜免疫应答的有效部位，经过肠道免疫可以产生较好的黏膜免疫应答，且免疫方法简单易行。如何使疫苗不受消化液的影响、使用少量的抗原有效地诱导黏膜免疫反应，提高黏膜免疫力是目前经消化道免疫急需解决的问题。

3.2 呼吸道

所谓呼吸道免疫主要是经鼻腔接种疫苗，疫苗也可通过气管激发机体免疫。鼻黏膜具有丰富的血管，接种的疫苗能吸收进入体循环，一般所需要的剂量少，鼻腔接种后可诱导激活扁桃体处的B淋巴细胞，在鼻或扁桃体激活的部分B细胞可进入血液循环迁移到远处黏膜组织。因此，鼻腔接种疫苗不仅能预防呼吸道感染，也能预防其他部位的感染。鼻腔接种操作简单，不需要专门器械，并可避免由于注射而带来的交叉感染。

3.3 生殖道

猪的一些病毒性疾病如猪伪狂犬病、猪蓝耳病及猪圆环病毒病可通过公猪的精液传播，导致大批母猪被感染，引起猪繁殖障碍性疾病。常规的注射免疫不能阻断这种传播，可通过在猪生殖道黏膜接种疫苗的方式，诱导相应的免疫应答，从而阻止疾病的传播，黏膜免疫是解决猪繁殖障碍性疾病的重要免疫方式。

3.4 直肠

猪直肠黏膜中有大量M细胞和淋巴细胞，能够进行局部黏膜免疫。

4 黏膜免疫在猪病毒病防控中的应用

4.1 猪流行性腹泻防控

猪流行性腹泻病毒（PEDV）对哺乳仔猪的危害严重，尤其对7日龄内的仔猪，因肠上皮细胞更新速度慢，死亡率更高，通过母乳获得的sIgA是仔猪抵抗病毒感染的关键。传统的母猪肌注灭活疫苗不能产生sIgA，而接种弱毒疫苗后可能会因弱毒含量低或在肠道中的增殖能力低或与当前流行毒株不匹配等问题，不能产生大量的sIgA，免疫效果差。而口服疫苗免疫可刺激母猪乳腺产生sIgA，sIgA在肠道中稳定性较好，可为仔猪提供被动免疫保护。Hou等[11]构建了能表达PEDV N基因的重组乳酸杆菌，经口服和滴鼻免疫小鼠后，检测其血清中抗PEDV的特异性IgG抗体水平。结果表明，重组菌能够刺激机体产生明显的免疫反应，口服和滴鼻免疫没有明显的差异。分别在70 d和84 d收集肠液和肺液，用间接ELISA检测黏膜IgA抗体水平，结果表明：无论是在小肠黏液中还是在肺泡液中均可检测到大量的抗体，这些抗体可以中和猪流行性腹泻病毒。葛俊伟等[12]构建了表达PEDV COE基因的重组乳酸杆菌口服免疫小鼠，测定其免疫应答水平。结果表明：免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA（P ＜ 0.01），血清具有中和活性（1:12），脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组，IL-4和IFN-γ水平极显著提高（P ＜ 0.01）。

4.2 猪传染性胃肠炎防控

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是经肠道黏膜感染的重要病毒，黏膜免疫在抵御病毒侵入机体过程中具有重要作用。宋振辉等[13]分别构建了含TGEV M及N基因的重组杆状病毒rBac-M和rBac-N，将两种重组病毒分别口服免疫小鼠，收集小鼠粪便检测sIgA抗体水平，并检测血清中IgG。结果显示：两种重组病毒均可诱导小鼠产生黏膜免疫和体液免疫应答。刘义等[14]将含有TGEV S基因的重组乳酸菌口服（灌胃）免疫BALB/C小鼠，首免、二免、加强免疫共免疫3次，每次免疫连续灌服3 d，间隔两周,免疫剂量为0.3～0.4 mL/只。第3次加强免疫后10 d，捕杀小鼠，采集血液、脾脏、粪便，处理后采用T淋巴细胞增殖试验及间接ELISA方法检查免疫小鼠对外源基因表达产物的应答情况。结果表明，免疫组小鼠血清中的IgG、粪便中的sIgA与对照组有显著差异（P ＜ 0.05）。

4.3 猪轮状病毒病防控

轮状病毒是引起婴幼儿和各种幼龄动物腹泻的主要病原之一。对轮状病毒感染所引起的胃肠炎没有特效治疗药物，只能通过疫苗免疫预防。目前，人用的轮状病毒疫苗可口服免疫，效果较好，猪轮状病毒口服疫苗的研制是疫苗研究的重要方向。叶丽萍等[15]构建了能表达轮状病毒Vp4的重组乳酸菌，大量培养后离心，加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服，检测血清抗体和肠黏膜sIgA水平，并进行小鼠免疫保护性试验。结果表明，该重组菌能增强小鼠的黏膜免疫反应，对猪轮状病毒强毒株的攻击具有一定的保护作用。

4.4 猪伪狂犬病防控

由于伪狂犬病病毒并不引起毒血症，而主要定植在三叉神经，使用gE缺失的弱毒疫苗局部黏膜免疫可以起到占位效应，从而抵抗野毒的感染。同时，黏膜免疫可以避免母源抗体对免疫产生的影响。用猪伪狂犬病病毒活疫苗在小猪1～3日龄喷鼻免疫，是猪场猪伪狂犬病净化的第1步，能有效抵御伪狂犬病野毒的入侵。喷鼻免疫一定要操作正确，选用专用的喷鼻器，最好不要进行滴鼻免疫，滴鼻时只有非常少的疫苗粘在鼻腔黏膜，大部分疫苗或通过吞咽反射进入胃内被胃酸灭活或直接流出，不能有效利用，如果能配合相应的佐剂，则能进一步提高黏膜免疫的效果。猪场在喷鼻免疫的基础上再做1～2次肌肉注射免疫以建立起细胞免疫，防控猪伪狂犬病。

4.5 猪支原体病防控

猪支原体能与相应的受体结合，并在黏膜部位的细胞内增殖，通过“占位效应”阻断野毒的“入侵”。猪支原体活疫苗可喷鼻免疫，也可进行喷雾免疫操作，当喷雾免疫时一定要控制气溶胶颗粒的大小，粒径太大只能吸入到咽部，粒径太小吸入后又会被呼出，只有一定粒径的才会停留于肺泡。另外，喷雾时一定要保持抗原的活性，否则就失去意义。如能解决保持粒径和活性这两个关键问题，气雾型免疫就会有很好的进展。

4.6 猪圆环病毒病防控

猪圆环病毒2型（PCV2）可经呼吸道、消化道、精液及胎盘等途径传播，能定植于黏膜系统（包括口鼻呼吸道、支气管、肺及胃肠道黏膜）然后开始复制，并伺机突破血液屏障进入血液循环和淋巴循环。传统的圆环病毒2型疫苗肌肉注射，只能获得体液免疫，无法阻止PCV2在黏膜系统的定植复制及向体外排毒，黏膜免疫产生sIgA可通过黏膜免疫中和病毒，全面清除机体中的病毒。英国皇家科学院用食用酵母菌为载体研制了圆环病毒病的口服疫苗为粉末状风干重组酵母，可稳定地表达PCV2b的壳蛋白，在母猪肠道建立了黏膜保护，从而显著降低病毒载毒量和排毒，防止临床疾病症状的发生，提高血清（IgG）和粪便（IgA）中的抗体水平，显著降低了母猪圆环病毒2型的排毒感染压力。

4.7 猪蓝耳病防控

猪蓝耳病病毒（PRRSV）可经呼吸道、消化道、生殖道等黏膜途径感染猪，通过黏膜免疫可阻断其感染。吴国军等[16]研究证实鼻黏膜免疫接种PRRSV CH-1R株弱毒疫苗，可以刺激机体产生较高的黏膜免疫反应和体液免疫反应，有效保护易感动物。Han等[17]构建了表达PRRSV的ORF7基因重组减毒沙门氏菌，经口服免疫小鼠12周后，在肠系膜淋巴结、小肠黏膜下淋巴集结、固有层淋巴细胞都检测到sIgA。王振华等[18]构建了表达PRRSV ORF6基因的重组乳酸杆菌，与黏膜佐剂CpG ODN联合鼻内免疫BALB/c小鼠，评价其佐剂效应。结果显示，CpG ODN佐剂协同重组菌抗原组的血清特异性抗体IgG高于单独佐剂组和抗原组，呼吸道和肠道黏膜sIgA水平高于单独佐剂组和抗原组，并且呼吸道黏膜sIgA抗体水平高于肠道黏膜抗体，最后一次免疫后14 d检测脾细胞悬液中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5的活性。IL-2、IFN-γ和IL-5的活性，佐剂CpG ODN协同重组菌抗原组高于单独抗原组（P ＞ 0.05）但不显著，极显著高于单独佐剂组（P ＜ 0.01），IL-4水平在各组之间差异不显著（P ＞ 0.05）。

4.8 口蹄疫防控

口蹄疫病毒（FMDV）经消化道、呼吸道进入动物机体，首先在咽喉部和扁桃体增殖，随后进入血液循环系统，因此黏膜免疫对预防口蹄疫具有重要意义。王潇等[19]分别构建了含FMDV VP1基因及小鼠IL-10基因的重组核表达质粒pcD-VP1和proVAX-IL-10，将两种重组质粒同时或pcD-VP1单独免疫小鼠，检测免疫效果，结果显示：与单独接种pcD-VP1相比，加入IL-10分子佐剂后可诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌，极大地提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应及CD4+T细胞中IL-4的表达量。张馨玉等[20]用壳聚糖来包被口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1形成纳米级颗粒，用此颗粒经滴鼻、口服、直肠和生殖道4种黏膜免疫小鼠，检测小鼠针对口蹄疫的体液和细胞免疫水平。结果显示，壳聚糖/pcDVP1滴鼻免疫小鼠，抗体的高峰来临比仅免疫pcD-VP1提前2周，直肠免疫处理中也呈现如此效果，经口服和生殖道途径的免疫，均没有呈现比pcD-VP1免疫组更好的抗体水平。但壳聚糖/pcD-VP1在生殖道和直肠免疫途径里均比pcD-VP1免疫组肠道集合淋巴结的T细胞增殖水平高。

4.9 猪流感防控

猪流感病毒（SIV）一般通过呼吸道黏膜感染猪，因此，如果能提高黏膜局部免疫力，可更有效阻止SIV感染。师小潇等[21]选择SIV血凝素（HA）的T、B抗原表位，将多个表位片段串联，克隆到原核表达载体pET-30a（+）中，对串联表达的重组SIV蛋白SIV-ep1、SW-ep2、SIV-el2，经灌胃途径免疫6周龄昆明小鼠，检测免疫小鼠抗体及细胞免疫水平。结果发现，3免后各免疫组血清IgG抗体与PBS对照组差异极显著（P ＜ 0.01），所有免疫蛋白组与PBS组黏膜sIgA抗体差异均极显著（P ＜ 0.01），细胞免疫检测显示：所有免疫组小鼠外周血T淋巴细胞增殖明显，SIV血凝抗体检测结果显示，SIV-ep1免疫组、SIV-ep2免疫组、SIV-ep1与LT蛋白免疫组抗SIV H1N1亚型HI效价达1∶1024，SIV-el2蛋白免疫组HI效价达1∶512。

5 小结与展望

黏膜免疫尤其对于一些经黏膜途径侵入动物机体的病原防控效果更好，与传统的免疫方式相比，黏膜免疫具有很多优点，对动物应激小，安全性好，既能产生局部黏膜免疫，形成黏膜抗体防护网，又能产生全身免疫应答反应，操作简便，省时省力，可发挥占位效应，适合规模化养殖场应用，是未来猪用疫苗研究的方向。但在黏膜疫苗的研制过程中也存在一些问题，如在免疫佐剂的选择、免疫途径的确定及如何保持抗原的活性且发挥最佳的免疫效果等方面还有很多工作需要研究。目前已有专家从猪体内分离出肠道定植的益生菌作为疫苗的载体，制备成可口服的疫苗，能使疫苗的效力达到最佳。黏膜佐剂的研制也取得了一定的进展，开发安全性、有效性、稳定性好的新型黏膜疫苗仍然是生物技术领域及生命科学工作者的重大挑战。相信随着分子生物学和免疫学理论与技术的发展，黏膜免疫将在今后猪病的防控中发挥越来越重要的作用。