肝窦内皮细胞调节肝脏免疫耐受的研究进展①

赵亚楠 臧超然 张永宏

(首都医科大学附属北京佑安医院生物医学信息中心，北京 100069)

肝窦内皮细胞(Liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)约占肝脏中非实质细胞的50%，约为肝脏血管内皮细胞的98%，比肝脏中常驻的巨噬细胞或淋巴细胞数量高出两倍[1]，虽然其在病原体检测、捕获以及抗原提呈中均发挥重要的作用，但却是诱导肝脏免疫耐受而非免疫活化的主要细胞。LSECs通过构成没有基底膜的内皮细胞层将血液与肝细胞分离开，并在内皮细胞层和肝细胞之间形成腔隙-Disse腔，这种结构上的分割限制了肝实质和血窦腔内物质的直接接触，但淋巴细胞可通过LSECs窗孔、LSECs之间的细胞旁连接或LSECs细胞进入Disse腔和肝实质，诱导T细胞对感染肝细胞的杀伤作用[2,3]，甚至还可通过LSECs之间的连接进行跨细胞游走。因此LSECs除摄入、加工、处理和递呈外源性抗原物质外，还可能发挥细胞内病原体免疫监视的作用[4]。另外LSECs在调节其他肝脏功能中也发挥重要的作用，如血管张力、肝细胞生长、血管生成、肝血窦重塑或肝脏损伤修复等[5]。因此LSECs功能障碍可导致血管舒张功能障碍、炎症反应、纤维化、肝再生功能障碍、病理性血管生成或血窦重塑等，进而导致肝硬化和门脉高压[6-8]。本文主要通过LSECs对血液中抗原物质的清除作用、LSECs在肝内发挥免疫调节作用以及诱导肝内T淋巴细胞免疫耐受方面的可能机制进行阐述，以明确在机体感染状态下LSECs诱导抗病毒或抗肿瘤免疫耐受的可能机制，进而深入思考针对肝内复杂的免疫调节机制，病毒抗原或肿瘤抗原诱导的免疫耗竭或免疫逃逸机制的实质是否与LSECs诱导CD8+T细胞的免疫耐受相关。

1 LSECs的清道夫作用

LSECs并非骨髓源性细胞，而是来源于肝常驻细胞，其可表达多种模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)如清道夫受体和甘露糖受体(CD206)，前者可使其发挥清道夫细胞的作用，清除血液中直径大于200 nm的大分子物质，后者可维持LSECs正常的内吞作用[9]。LSECs摄取的大分子物质，一部分可通过转胞作用转移至肝细胞，进而被排泄入胆管或在肝细胞内被代谢，另一部分可以作为抗原物质被LSECs递呈给血液循环中的幼稚T细胞。同时其还可表达协同刺激分子CD80、CD86和CD40，骨髓源性细胞的典型分子如CD4和CD11c，主要的组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ和MHCⅡ分子[10]，低密度脂蛋白受体相关蛋白1，肝/淋巴结特异性细胞间黏附分子-3结合非整合素分子(Liver/lymph node-specific ICAM-3 grabbing non-integrin，L-SIGN),肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素，以及淋巴管内皮透明质酸酶受体等来调节肝脏的脂质代谢以及抗病毒免疫应答[9]。

血液循环中的抗原在肝内大多由LSECs摄取，与树突状细胞(Dendritic cells，DCs)不同的是，LSECs并不通过甘露糖受体摄取抗原而是依赖于L-SIGN或者其他C型凝集素等调节的内吞作用。抗原被内吞入LSECs后可被快速地转运至内涵体中，并且LSECs将不同时间内摄取的抗原随时间分隔，通过类似于传送带的方式提高自身的清除能力，同时这些被LSECs摄取的外源性抗原可在细胞内与内源性抗原肽竞争结合MHCⅠ分子。然而并不是所有的抗原被LSECs内吞后都发生类似的细胞内通路，那些活化CD4+T细胞和B细胞并诱导抗体产生的抗原并不会被LSECs递呈，进而避免诱导CD8+T细胞的免疫耐受，从而发挥抗感染作用[11]。另外研究发现LSECs并不能有效地将内吞抗原递呈给溶酶体，而是可以将内吞的分子通过载体从管腔侧转运至肝细胞，因此LSECs的转胞作用在清除大分子物质和感染早期清除嗜肝病毒方面均发挥重要的作用[10]。但LSECs清除病毒的功能与病毒本身的毒性相关，例如与弱毒性的鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)相比，在强毒性MHV3感染的条件下，其可活化LSECs内TLR2信号通路，诱导LSECs促炎介质的释放，抑制IL-10和NO的产生，并可促进血管血栓的形成[12]。而血小板与LSECs表面整合素αⅡbβ3和αⅤβ3结合后，可活化LSECs释放化学趋化因子，如CXCL8和CCL2等，从而促进中性粒细胞和淋巴细胞在肝窦内的募集[13]。

2 LSECs的免疫调节作用

LSECs是肝脏内主要的免疫防御细胞和抗原递呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)，肝窦直径约为5～7 μm，加上间断的血流特点以及血液灌注压力低，更促进了白细胞与肝内细胞的接触。诱导肝脏免疫耐受的细胞主要是LSECs、库否细胞(Kupffer cells，KCs)和肝细胞，各类细胞在免疫调节中的作用相互联系但又有所不同，如LSECs诱导肝脏免疫耐受以及抗炎的功能明显强于KCs[14]，但在炎症条件下，KCs可分泌促炎细胞因子IL-6，后者与LSECs表面受体结合间接活化STAT3，反而发挥保护Fas诱导的LSECs和肝细胞的凋亡或肝脏损伤[15]。作为非专职APC，LSECs表面可表达多种免疫受体、协同受体、协同刺激分子和黏附分子等与淋巴细胞相互作用所需的分子，如各种PRRs：TLR、 NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)、MHCⅠ和MHCⅡ、协同刺激分子CD80和CD86等。LSECs诱导的免疫耐受与其表面表达限制性TLR和其分泌的抗炎细胞分子相关，而活化NLRs则可抑制LSECs诱导的免疫耐受，促进T细胞免疫应答[16]。LSEC与肿瘤细胞免疫耐受及肿瘤肝内转移均相关，经肝内血源性播散的时候可由肝NK1.1+细胞诱导肿瘤细胞的凋亡，其凋亡的肿瘤细胞片段在局部可被LSECs摄取以清除凋亡物质，但LSECs通过交叉递呈作用可将肿瘤相关抗原递呈给幼稚型CD8+T细胞，反而诱导其活化增殖为免疫耐受表型，导致细胞因子表达丧失、特异性细胞毒性缺乏以及肿瘤在肝内播散[17-19]。巨噬细胞和DCs等骨髓源性APC对抗原的交叉递呈作用需要高浓度的可溶性抗原(≥20 μmol/L)，而LSECs对低浓度的抗原(≤1 nmol/L)便发挥有效的交叉递呈作用，并且可调节肝内免疫耐受机制的形成。DCs可以根据细胞类型、分化状态以及微环境来确定其交叉递呈作用是诱导免疫应答还是免疫耐受，而LSECs在诱导CD8+T细胞免疫耐受同时可提高幼稚型CD8+T细胞表面Bcl-2的表达水平进而抑制免疫耐受的T细胞发生凋亡，但是在诱导特异性T细胞无功能和凋亡之前，LSECs递呈的抗原仍可刺激CD8+T细胞增殖[20,21]。

LSECs诱导肝脏的免疫耐受机制包括表达Fcγ受体清除血液中可溶性免疫复合物、调节Tregs的产生、抑制抗原特异性DCs对T细胞的活化作用以及通过直接接触诱导肝内活化的T细胞凋亡等，然而在肝纤维化时，LSECs可发生表型转换，诱导Tregs产生以及抑制DCs免疫原性的功能均降低，并可释放促炎细胞因子、活化T细胞，诱导适应性免疫应答[22-24]。在慢性酒精性肝病中，LSECs通过活化NF-κB、低氧诱导因子-1α和转录因子AP-1来提高调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子的表达发挥促炎作用，而在非酒精性脂肪性肝炎中，LSECs通过降低趋化因子如CCL2和CXCL16等的表达，抑制单核细胞向炎性部分的浸润，进而发挥抗炎症作用[25，26]。另外LSECs表面清道夫受体在炎性调节因子的作用下可募集CD4+T细胞至肝脏进而调节肝内的炎症反应，并且在调节肿瘤免疫中发挥作用[27]。

LSECs活化幼稚型CD8+T细胞并不依赖于炎症反应调节的协同刺激分子的上调，由此表明在病毒尚未诱导炎症反应阶段即可发生LSECs交叉活化作用。在HBV病毒感染时，血液中存在大量的HBV表面抗原(HBsAg)并由DCs发生交叉递呈作用[28]，然而不成熟的DCs则可诱导HBsAg特异性CD8+T细胞的无功能或耗竭。而LSECs活化幼稚型病毒特异性CD8+T细胞则可以保护T细胞的清除，且LSECs交叉活化CD4+T细胞可辅助上调HBV特异性CD8+T细胞的数量，进而增强T细胞对病毒感染肝细胞的效应功能[29,30]。但LSECs交叉递呈HBV抗原至特异性CD8+T细胞的功能障碍，与HBV逃避非典型CD8+T细胞效应功能导致持续的病毒感染有关[31]。另外，HBV感染的持续存在也是因为在急性感染期间固有免疫应答的缺陷以及在缺乏炎症反应的条件下病毒抗原的大量释放导致的，这两种状态均缺乏炎症反应和循环中病毒抗原的大量释放与诱导T细胞发展为耗竭表型有关[32]。除了经典的MHC-Ⅰ限制性识别病毒感染的肝细胞外，由LSECs交叉递呈肝细胞源性病毒抗原至CD8+T细胞，并诱导其活化的过程称为非经典CD8+T细胞效应功能，由该途径活化的T细胞释放的控制炎症反应的细胞因子主要为TNF，而非干扰素(Interferon，IFN)[33]，TNF可活化病毒感染的肝细胞内TNF受体信号通路，进而活化细胞凋亡蛋白酶，诱导病毒感染的肝细胞死亡[34]。

3 LSECs诱导CD8+T细胞免疫耐受

CD8+T细胞在肝内的黏附可发生在感染区无炎症反应的条件下，与淋巴细胞在血管后微静脉黏附机制不同的是，肝窦中CD8+T细胞的运动速度比肝血窦内血液流速慢500～1 000倍，且其运动不依赖于肝窦内的血流方向[35]，而黏附于募集在LSECs表面的血小板上，这可能与血小板募集改变局部的血流动力学有关，但也可能存在不依赖于血小板的黏附机制[31,36]，另外肝内低灌注压、不规则灌注以及非选择素依赖的黏附均是抗原特异性幼稚型CD8+T细胞黏附至LSECs的原因。肝细胞、不成熟的DCs以及非实质细胞如KCs和LSECs均可诱导CD8+T细胞的免疫耐受，其中肝细胞递呈的抗原如自身免疫性抗原或病毒抗原还可诱导抗原特异性CD8+T细胞的清除。LSECs诱导幼稚型CD8+T细胞耐受是指其可以诱导CD8+T细胞的活化和增殖，但是当T细胞受体(T cell receptor，TCR)调节的刺激再次发生时，CD8+T细胞缺乏产生IL-2/IFN-γ的能力，即这些活化的CD8+T细胞无效应功能，故而称为耐受[37]。

LSECs在活化幼稚型CD4+和CD8+T细胞的同时，还可通过直接接触的方式抑制肝内DCs表达协同刺激分子CD80、CD86以及IL-2，进而抑制DCs对幼稚型CD8+T细胞的活化作用，甚至在促炎信号如IFN-γ和脂多糖诱导DCs成熟的条件下，LSECs可通过这种直接接触作用抑制DCs活化幼稚型CD8+T细胞，同时为自身提供额外的时间来进行抗原递呈并诱导CD8+T细胞免疫耐受，但是一旦循环中活化的CD8+T细胞数量达到一定程度，LSECs则不能干扰DCs刺激已活化的CD8+T细胞，进而使DCs继续保持免疫监视功能[38]。同时幼稚的CD8+T细胞需受到持续有效的TCR信号刺激才可活化为效应性T细胞[39]，在缺乏炎症信号作用下，LSECs可诱导幼稚CD8+T细胞为记忆样T细胞，而后者在TCR、CD28和IL-12受体信号通路传导的联合刺激作用下可重新活化[36]。虽然IL-12是诱导CD8+T细胞活化的主要因子，但IL-12受体的表达依赖于CD28分子的协同刺激作用，LSECs与抗原特异性CD8+T细胞相互作用导致CD28的表达降低，也可导致CD8+T细胞不能有效地IL-12活化[20]。

LSECs作为APC与抗原特异性CD8+T细胞相互作用可以诱导自身表面协同抑制分子B7-H1以及幼稚型CD8+T细胞表面抑制性分子PD-1的表达水平上调，CD25和CD28分子表达降低，磷脂酰肌醇3-激酶活化受抑以及IL-2的产生降低，进而抑制T细胞的活化和功能，而且这种抑制作用持续一定时间后并不能被协同刺激信号所逆转[40]。与肝细胞和肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)表达B7-H1来诱导T细胞凋亡不同的是，LSECs通过B7-H1信号可促进免疫耐受CD8+T细胞的生存[20]。然而进一步研究发现LSECs诱导免疫耐受或免疫活化的机制与抗原浓度有关，高浓度抗原刺激下，LSECs可活化幼稚型CD8+T细胞为效应性T细胞，而当抗原浓度较低或机体缺乏炎症反应的条件下，LSECs诱导幼稚型T细胞上调CD69、CD44和PD-1的表达，诱导T细胞免疫耐受，且PD-1的表达水平与TCR信号的强度相关，与LSECs表面B7-H1的表达水平不相关[41]。与既往认为T细胞活化需要提高协同刺激信号的作用不同的是，在早期缺乏有效的B7-H1抑制信号的作用下，TCR信号的持续活化可诱导CD8+T细胞自身分泌IL-2，而IL-2诱导CD8+T细胞活化可不依赖于T细胞表面协同刺激信号的表达，便可诱导幼稚性T细胞分化为效应性T细胞。通常LSECs表面B7-H1分子的表达水平决定T细胞是否被诱导耐受，但是在抗原的持续作用下B7-H1的表达水平并不升高，而PD-1的水平与TCR信号有很大的关联性，因此考虑T细胞可能具有PD-1信号的反向传递作用，并导致其自身的免疫耐受[41]。

4 LSECs诱导CD4+T细胞免疫耐受

LSECs表达协同刺激分子、MHCⅡ分子以及其有效摄取抗原的能力均表明其可将可溶性抗原递呈给CD4+T细胞，并促进CD4+T细胞的增殖以及IFN-γ的释放，且LSECs对CD4+T细胞的抗原递呈效应可被其他的肝内细胞如HSC和KCs释放到局部微环境中的调节因子如前列腺素E2和IL-10所调节，诱导LSECs细胞表达较低水平的协同刺激分子CD80和CD86，以及较高水平的协同抑制分子PD-L1，进而诱导LSECs通过细胞间直接接触以及PD-1/PD-L1信号通路来抑制DCs诱导的CD4+T细胞的活化，并在不抑制其增殖的条件下抑制其炎症细胞因子的分泌[42]。另外LSECs还可通过TGF-β或Notch依赖的信号通路将幼稚型CD4+T细胞分化为Foxp3阴性的调节性CD4+T细胞[43]，并且在炎症环境下IFN-γ或IL-10的刺激可诱导LSECs表面凝集素表达水平升高，后者可以抑制病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的抗病毒活性，进而诱导病毒的免疫逃逸[44]。同时门脉血液中也包含可以直接影响LSECs抗原递呈效应的调节因子如内毒素，内毒素不影响其他APC对肠源性抗原的处理能力，但是可以降低LSECs处理肠源性抗原的能力，并且降低其表面MHCⅡ分子、CD80和CD86分子的表达，上调CD54的表达，进而抑制CD4+T细胞的活化[45]，而高表达的ICAM-I还可参与调节肝内活化CD8+T细胞的清除[46]。

LSECs和DCs的抗原递呈作用均可诱导Th1细胞活化，DCs诱导CD8+T细胞的活化需要自身功能的成熟以及CD4+T细胞的辅助，而LSECs诱导的CD8+T细胞的活化不依赖其自身功能成熟，但需要CD4+T细胞的辅助。在CD8+T细胞重定位在淋巴组织之前，LSECs激活的Th1细胞可辅助LSECs诱导CD8+T细胞的活化，且这种调节方式下的活化并不导致幼稚型CD8+T细胞耐受和抗原特异性CD8+T细胞的清除，而是导致幼稚型CD8+T细胞功能重组成为具有增殖潜能的记忆性T细胞，但在CD8+T细胞分化为记忆表型之前，Th1的活化并不诱导协同刺激分子的表达而是提高MHCⅠ的表达，后者可以增加TCR的信号传导作用。LSECs激活的Th1细胞释放的IL-2，其与T细胞表面高亲和力的IL-2受体结合，诱导由TCR信号和IL-6反式信号联合作用的CD8+T细胞内颗粒酶B(GzmB)的快速表达，从而发挥短暂的效应功能，而GzmB阳性的CD8+T细胞可发展为记忆性CD8+T细胞并转移至次级淋巴组织，在TCR和协同刺激分子的共同作用下可再次活化为效应性T细胞[29,37,47]。

综上所述，LSECs是肝脏内重要的非专职APC，其在清除病原体、代谢产物以及维持肝脏正常的生理功能和免疫调节方面发挥重要的作用，其可协同其他APC如KCs和DCs共同调节T淋巴细胞在肝脏微环境中的免疫应答以及免疫耐受作用。但肝脏病理性的改变如肝血窦结构紊乱可导致窗孔丢失，失窗孔的LSECs可活化HSC，而后者的活化反之又可调节LSECs的基因表达，两者相互调节、相互作用可促进纤维基质的形成，诱导肝脏结构紊乱，LSECs功能改变[48,49]。例如在自身免疫性肝病中，抗LSECs自身抗体可诱导LSECs产生化学因子IL-8和单核细胞趋化蛋白-1，进而募集单核细胞和淋巴细胞至肝脏内的炎症部位，并通过释放多种细胞因子和化学因子导致慢性炎症反应[50]。而在炎症状态下LSECs分泌胶原蛋白Ⅳ和层黏连蛋白，促进细胞外基质的形成以及LSECs的毛细血管化[51]，促进肝纤维化和肝硬化的发生和发展。而在肝纤维化或肝硬化条件下，LSECs可能失去调节T细胞的能力，进而改变肝脏的免疫状态，导致病毒的持续存在或者抗肿瘤功能障碍。尽管在多种情况下LSECs和其他APC如DCs具有共同的表型以及递呈外源性抗原的能力，但两者在肝脏免疫调节方面具有不同的功能特征。通过深入了解LSECs诱导肝脏免疫耐受机制，以及感染状态下其调节免疫应答的机制，可以为肝脏疾病的诊断、治疗以及明确持续病毒感染或抗肿瘤功能障碍的可能机制提供新的有效研究思路。