PF-4708671和NVP-BEZ235联合用药协同抑制MDA-MB-436和A549细胞增殖

彭培佩＊，王 健＊，陈 晨3，，黄 芳，王 芃，李山虎，王 辉

（1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东广州 510006；2.军事科学院军事医学研究院生物工程研究所细胞工程实验室，北京 100850；3.河南科技大学医学院，河南洛阳 471023；4.北京城市学院生物医药学部，北京 100083）

p70核糖体S6激酶β-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1）属于蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节西罗莫司（雷帕霉素）复合物1〔mammalian target of sirolimus（Rapamycin）complex 1，mTORC1〕蛋白激酶下游的蛋白质合成和细胞生长［1-2］，而作为40S核糖体亚基组成部分的S6蛋白是S6K1最重要的底物之一［3］。通常认为，mTORC1-S6K1信号轴调控细胞转录、翻译、蛋白质合成、脂质合成、细胞生长和细胞代谢等过程。因此，S6K1在包括肥胖、糖尿病、衰老和癌症等许多疾病中起重要作用，研究者已提出通过抑制该激酶活性来治疗癌症和胰岛素抗性的策略［4-5］。

PF-4708671是S6K1的特异性抑制剂，通过诱导依赖于mTORC1的S6K1的T环和疏水基序的磷酸化，进而抑制S6K1底物S6蛋白的磷酸化［6］。研究表明，PF-4708671能抑制线粒体复合物Ⅰ，导致线粒体功能异常，并诱导过量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生，通过激活胱天蛋白酶或释放细胞色素c，最终导致细胞死亡［6-8］。另外，最近的研究还发现，PF-4708671也可通过减少抗凋亡蛋白的表达，诱导对他莫昔芬耐药的MCF-7细胞死亡［9-11］。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和mTOR信号通路是细胞内重要的传导通路之一，与细胞生长、增殖和凋亡密切相关［12］。PI3K/AKT/mTOR信号通路在多种癌症中被激活，其激活机制包括肿瘤抑制因子磷酸酶和张力蛋白同源性（phosphatase and tensin homolog，PTEN）基因功能的丧失、PI3K的扩增或突变、AKT的扩增或突变和生长因子受体的激活等［13］。一系列临床研究均表明，mTOR激酶抑制剂（如西罗莫司及其衍生物依维莫司等）可用于治疗如食管鳞状细胞癌、肺癌、肾细胞癌和前列腺癌等实体瘤，而许多PI3K/AKT/mTOR信号分子的靶向性药物也正处于临床前开发或早期临床试验阶段［13-14］。但临床试验也发现，mTOR激酶抑制剂西罗莫司和依维莫司在抑制S6K1活性的同时能反馈激活AKT信号通路，继而通过调控Bcl-2、叉头框蛋白家族因子、凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）、胱天蛋白酶9、糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）、结节性硬化症复合物2（tuberous sclerosis complex 2，TSC-2）等分子活性抑制肿瘤细胞凋亡、促进增殖等作用减弱治疗效果［15-17］。为此，本研究通过探索S6K1抑制剂PF-4708671调控PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用机制，提出与NVP-BEZ235联合用药的策略，以期对肿瘤靶向性治疗临床用药提供有益的线索。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂和主要仪器

感受态细胞大肠杆菌DH5α、人乳腺癌细胞MDA-MB-436和肺癌细胞A549购自美国ATCC；西罗莫司（sirolimus）、PF-4708671和NVP-BEZ235购于美国Selleck公司；山羊抗微管蛋白（γ-Tubulin）多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗磷酸化AKT473（p-AKT473），p-S6，AKT和S6K1多克隆抗体均购于美国Cell Signaling公司；山羊抗兔和兔抗山羊IgG抗体购于北京中杉金桥生物公司；DMEM高糖培养基和胰蛋白酶购于美国Gibco公司；二甲亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；青霉素和链霉素购于华北制药有限公司；嘌呤霉素购于美国HyClone公司；蛋白酶抑制剂和甲紫（结晶紫）购于美国Amresco公司；BCA蛋白定量试剂盒、CO2恒温培养箱和MULTISKAN FC酶标仪均购自美国Thermo公司；ECL发光液购于北京天根生化科技有限公司；Cell Counting Kit 8（CCK8）试剂盒购于东仁化学科技有限公司；Lipo3000试剂盒购于赛默飞世尔中国；5417R低温高速离心机及5418台式室温离心机购于德国Eppendorf公司；电泳槽和湿转膜仪购于美国Biorad公司。

1.2 细胞培养

MDA-MB-436和A549细胞均用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和链霉素0.1 g·L-1的DMEM高糖培养基在37℃，5%CO2的培养箱中培养。待细胞生长密度长到80%～90%时进行传代培养。

1.3 质粒构建和转化

根据相关文献［18］，利用PLKO.1载体设计干扰S6K1表达的短发夹RNA（sh-S6K1），引物序列为F：CC⁃GGGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATT⁃GGAAGTGGTGCCGATGCTTTTTG；R：AATTCAAAAAGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATTGGAAGTGGTGCCGATGC。引物由北京赛百盛生物工程公司合成，4℃保存。使用PLKO.1载体按胶回收试剂盒（Axygen公司）说明书进行酶切回收，将设计的短序列进行退火连接，将载体片段和退火片段通过T4连接酶进行连接，将连接产物利用大肠杆菌DH5α进行转化，涂氨苄平板，挑单克隆摇菌，按质粒提取试剂盒（Axygen公司）说明书提取质粒，并测定浓度，-20℃保存。送生物工程（上海）股份有限公司北京测序部得到测序结果。按照Lipo3000试剂盒说明书操作，获得稳定敲低S6K1表达的MDA-MB-436和A549细胞。

1.4 Western蛋白印迹法检测p-AKT473，AKT和S6K1蛋白水平

在接种MDA-MB-436和A549细胞的培养皿内加入终浓度为30 μmol·L-1的PF-4708671，处理0，1，3，6，12和24 h后收取细胞；以及单独或联合加入PF-4708671（30 μmol·L-1）或西罗莫司（10 nmol·L-1）处理24 h后收取细胞；向接种敲低S6K1的上述2种细胞的培养皿中加入终浓度为30 μmol·L-1的PF-4708671，处理24 h后收取细胞；以及单独或联合加入 PF-4708671 30 μmol·L-1或 NVP-BEZ235 100 nmol·L-1，处理24 h后收取细胞；用含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，利用BCA比色法在酶标仪570 nm处检测吸光度（A570nm）值，测定标准曲线得出蛋白样品的浓度。向蛋白样品中加入5×SDS加样缓冲液并煮沸8 min，对蛋白进行预变性处理。以10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品后，在湿转装置中以200 mA进行恒流转膜2.5 h，在5%脱脂奶粉中封闭约30 min。使用5%的脱脂奶粉稀释一抗（p-AKT473，AKT和S6稀释比例为1∶1000，p-S6稀释比例为1∶3000），在4℃的摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次后加入二抗（稀释比例1∶5000）室温孵育6 h，之后用TBST洗膜3次，每次5 min，以ECL法显影及定影。胶片经扫描后用Image J进行积分吸光度分析。

1.5 CCK-8法检测细胞存活

将处于对数生长期的上述2种细胞消化后，按每孔分别3500和2500细胞接种到96孔板中，每孔重复3次，置于CO2培养箱24 h后，各孔单独加入0，10，20，30和40 μmol·L-1的PF-4708671或联合加入 NVP-BE235（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：1 μmol·L-1）抑制剂72 h后去除原孔内培养液，每孔加入100 μL稀释后的CCK8工作液（按CCK8原液与培养液1∶9的比例配制）继续孵育2 h，而后利用酶标仪在450 nm处检测吸光度（A450nm）值，细胞存活率（%）=（加药组A450nm-空白组A450nm）/（正常对照组A450nm-空白组A450nm）×100%。实验重复3次。

1.6 平板克隆形成实验检测细胞增殖

将处于对数生长期的上述2种细胞按每孔3000细胞接种到6孔板内，待孔内细胞克隆生长到一定大小时，单独或联合加入PF-4708671（30 μmol·L-1）和NVP-BEZ235（100 nmol·L-1），6 d后去除原培养液，加入PBS洗涤3次，加入甲醇固定细胞层约30 min，加入甲紫染液染色30 min，用流水缓慢清洗孔内剩余染料后放置于室内风干。显微镜下计数≥10个细胞的克隆数。实验重复3次取平均值。

1.7 统计学分析

计量资料以±s表示。使用SPSS19.0进行数据处理和统计学分析，Studentt检验（或校正t检验）用于两组间比较；单因素方差分析进行多组比较，P＜0.05为具有统计学意义。应用Chou-Talalay方法分析联合用药后的联合指数（combination index，CI），定量描述联合用药的相加作用（CI=1）、协同作用（CI＜1）以及拮抗作用（CI＞1）。

2 结果

2.1 PF-4708671对MDA-MB-436和A549细胞中p-S6及AKT表达水平的影响

Western蛋白印迹结果（图1）显示，PF-4708671 30 μmol·L-1作用于上述2种细胞后，p-S6蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），而p-AKT473蛋白表达水平显著上升（P＜0.01），同时AKT总蛋白表达水平无明显差异（图1A，C）。表明S6K1抑制剂PF-4708671抑制上述2种细胞中S6磷酸化水平的同时能反馈激活AKT活性。

Fig.1 Effect of PF-4708671（PF）on protein expression levels of protein kinase B（AKT），p-AKT473，S6 and p-S6 in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.Cells were treated with PF 30 μmol·L-1for 0，1，3，6，12 and 24 h，respectively.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with p-AKT473 in 0 h group；##P＜0.01，compared with p-S6 in 0 h group.

2.2 PF-4708671和西罗莫司联用对MDA-MB-436和A549细胞中p-S6及AKT表达水平的影响

Western蛋白印迹结果（图2）显示，单用或联用mTOR抑制剂西罗莫司10 nmol·L-1和PF-4708671 30 μmol·L-1作用上述2种细胞，均能抑制p-S6活性并导致AKT反馈激活（P＜0.01）；当两者联用时，对p-S6活性有进一步的抑制（P＜0.01），且进一步激活了AKT活性（P＜0.01），AKT总蛋白表达水平无明显差异（图2A，C）。表明在上述2种细胞中，西罗莫司和PF-4708671在抑制S6K1活性的同时都能导致AKT反馈激活，且具有叠加作用。

2.3 PF-4708671对敲低S6K1的MDA-MB-436和A549细胞中S6K1及AKT表达水平的影响

Western蛋白印迹结果（图3）显示，敲低S6K1后，ATK活性相较于野生型细胞明显上升（P＜0.01）；用PF-4708671作用野生型细胞时，能导致p-AKT473表达水平显著增加（P＜0.01），但用PF-4708671作用于敲低S6K1后的上述2种细胞时，其对p-AKT473的表达水平增加的程度明显低于PF-4708671作用野生型细胞中p-AKT473增加的水平（P＜0.01）（图3E），同时AKT总蛋白表达水平无明显差异（图3A，C）。这一研究表明，敲低S6K1后的确能显著增加p-AKT473表达水平，同时PF-4708671可通过抑制S6K1激活AKT活性。

Fig.2 Effect of PF combined with sirolimus（Sir）on protein expression levels of p-AKT473，AKT，S6 and p-S6 in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.Cells were treated with PF（30 μmol·L-1，24 h）and Sir（10 nmol·L-1，24 h）alone or in combination.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control（NC）group.

Fig.3 Effect of PF on ribosomal protein S6 kinase beta-1（S6K1）and p-AKT473 expression levels in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells after S6K1 was knocked down by small interfering RNA（sh-S6K1）by Western blotting.The sh-S6K1 cells were treated with PF 30 μmol· L-1for 24 h.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C，respectively.E was the changes in p-AKT473 expression in wild-type（WT）and sh-S6K1 cells after being treated with PF，and was the semi-quantitative analysis of A and C.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group；△△P＜0.01，compared with corre⁃sponding WT group.

2.4 PF-4708671联合NVP-BEZ235对MDA-MB-436和A549克隆形成和细胞存活的影响

Western蛋白印迹结果（图4）显示，PI3K/mTOR双重抑制剂NVP-BEZ235可显著抑制由PF-4708671所导致的p-AKT473活性增强（P＜0.01）。平板克隆结果（图5A-D）显示，与单用PF-4708671或NVP-BEZ235相比，两者联合处理后MDA-MB-436及A549细胞的克隆形成数显著降低（P＜0.01）。CCK8结果（图5E，F）表明，与正常对照组相比，单用PF-4708671及NVP-BEZ235均具有抑制肿瘤细胞生长的效果（P＜0.01），但2种抑制剂联用时，显著增强了抑制肿瘤细胞生长的作用（P＜0.01），且两药联用存在协同作用（CI＜1）。

Fig.4 Effect of PF combined with NVP-BEZ235（BEZ）on expression levels of AKT，p-AKT473，S6 and p-S6 kinase in MDA-MB-436（A，B）and A549（C，D）cells by Western blotting.The cells were treated with PF（30 μmol·L-1，24 h）and BEZ（100 nmol·L-1，4 h）.B and D was the semi-quantitative analysis of A or C，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding NC group.

Fig.5 Effect of PF combined with BEZ on clonal formation and cell survival of MDA-MB-436（A，B，E）and A549（C，D，F）.A and C：the cells were treated with PF（MDA-MB-436：20 μmol·L-1；A549：60 μmol·L-1）and BEZ（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：20 nmol·L-1）alone or in combination for cloning experiment respectively.B and D：count analysis of each hole for A and C.E and F：the cells were treated with the indicated concentrations gradient of PF with BEZ（MDA-MB-436：8 nmol·L-1；A549：1 μmol·L-1）alone or in combination for cell survival assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with NC group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PF+BEZ group.

3 讨论

本研究发现，S6K1抑制剂PF-4708671和PI3K/mTOR激酶抑制剂NVP-BEZ235联用于乳腺癌细胞MDA-MB-436和肺癌细胞A549，可显著增强单用时对肿瘤细胞的生长抑制作用。

PI3K/AKT/mTOR信号通路与多种癌症的发生有关，因而被认为是靶向性治疗的有效靶点，但是常常由于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK）信号增强，或和其他促生长信号通路之间的交互作用，导致耐药性和不良预后的发生［19-21］。

PI3K/AKT/mTOR信号通路激活下游的S6K1以调节细胞代谢、增殖［22］。有研究发现，激活的S6K1可抑制PI3K上游调控分子胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的功能活性，导致PI3K/AKT通路无法被正常激活而表现出一种负反馈调控机制［2］。因此，当用西罗莫司抑制mTORC1会解除S6K1反馈抑制环路而导致AKT的持续激活，使得肿瘤细胞对西罗莫司产生耐药性，减弱其潜在的抗癌活性［23］。但也有研究对此结论提出了质疑。Wang等［24］研究发现，用S6K1抑制剂或者直接敲低S6K1表达都不能激活AKT活性，进而认为西罗莫司或mTORC1抑制剂不是通过解除IRS-1/PI3K/AKT信号通路的负反馈调控来激活AKT活性。而本研究的结果发现，S6K1抑制剂PF-4708671和西罗莫司具有相似的作用分子机制，都可以通过抑制S6K1活性来激活AKT活性。本研究首先发现，用S6K1抑制剂PF-4708671处理MDA-MB-436和A549细胞后抑制S6K1活性同时相应激活了AKT活性；而通过敲低肿瘤细胞中S6K1表达，可直接上调AKT磷酸化水平，说明S6K1直接参与了负调控ATK活性。同时发现，在敲低S6K1表达的突变型细胞中，PF-4708671依然能激活AKT活性；但相对于野生型细胞而言，PF-4708671对ATK的激活程度显著减弱，这都提示PF-4708671激活AKT活性的分子机制可能是通过抑制S6K1活性来实现的。

由于AKT的激活经常与细胞生存和抗癌治疗有关，因而认为PF-4708671作用下的AKT激活也会减弱PF-4708671的抗肿瘤作用。因此，本研究首先证实PF-4708671对AKT的反馈激活可被PI3K和mTOR双重ATP竞争性抑制剂NVP-BEZ235所阻断，在此基础上提出了联合用药的策略。研究结果证实，在PF-4708671和NVP-BEZ235联用时显著增强PF-4708671单用对肿瘤细胞的抑制作用。因此，对于PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活所导致的肿瘤，可通过联用S6K1抑制剂和PI3K/AKT抑制剂来增强靶向性治疗的效果。