RF-LAMP技术检测肉制品中沙门氏菌的研究

徐 慧，陈发荣，王保娟，王 永，石 磊，陈 洵，常彦磊，时国强，6，张 伟

（1.河北农业大学，河北保定 071001；2.北京艾旗斯德科技有限公司，北京 101102；3.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300232；4.暨南大学食品安全与营养研究院，广东广州 510632；5.广州双螺旋基因技术有限公司，广东广州 510320；6.河北三狮生物科技有限公司，河北石家庄 050011）

沙门氏菌（Salmonella） 是一种常见的食源性致病菌，属肠杆菌科、革兰氏阴性肠道杆菌[1]，主要寄生于人类和动物肠道中，可致食物中毒、慢性肠炎、肠热症等[2]。因沙门氏菌经常存活于肉制品、蛋类、水产品中，在20℃以上即能大量繁殖，世界各国普遍规定食品中不得检出沙门氏菌[3]。根据数据统计，人摄入含有一定量沙门氏菌（1×106～1×107CFU/g）的动物性产品后易引发细菌性感染，我国每年细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4-5]。

目前，常用的沙门氏菌检测方法有传统方法如国家标准、AOAC等，以免疫学为基础的检测方法如酶联免疫法（ELISA）等，以分子生物学为基础的检测方法如聚合酶链式反应（PCR） 等[6]。传统方法培养时间较长，一般需要3～4 d检测时间[7]。ELISA方法从样品的制备到检测结束大概要40～48 h才能完成，且由于使用的多价血清存在不同程度的交叉反应，容易产生假阳性[8]。PCR方法需要昂贵的PCR仪器和繁琐的电泳，故不宜普遍推广。因此，亟需开发一种快速检测食品中沙门氏菌的检测方法，对于保障我国食品安全具有重要意义。

研究在环介导等温扩增法（LAMP）[9]基础上，结合荧光染料SYBR Green I建立的一种实时荧光LAMP（RF-LAMP）技术，为实现沙门氏菌的快速检测提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

试验所用菌株包括甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、大肠杆菌O157∶H7、产气荚膜杆菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌。

1.1.2 样品

肉制品，购自保定市某超市。

1.1.3 主要培养基和试剂

营养肉汤和营养琼脂，北京陆桥技术股份有限公司提供；Bst DNA聚合酶、MgCl2和dNTPs，大连宝生物工程有限公司提供；荧光试剂，Sigma公司提供；实时荧光LAMP内、外引物，合成于大连宝生物工程有限公司；DNA提取试剂盒，北京全式金生物技术有限公司提供。

1.1.4 主要仪器

WH-861型旋涡混合器，太仓市科教器材厂产品；数显超级恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司产品；QYC-200型全温摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；实时荧光监测仪，德国ESE Gmbh公司产品；TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂产品。

1.2 方法

1.2.1 纯菌的培养

取保藏的菌株接种于灭菌的NB液体培养基中，于37℃条件下振荡培养过夜。

1.2.2 DNA模板的制备

研究采用热裂解法进行DNA模板的提取。取过夜培养的菌悬液1.5 mL于灭菌离心管中，以转速11 000 r/min离心1 min，弃去上清液。加入300 μL无菌蒸馏水洗涤菌体沉淀，重复2次，然后加入100 μL无菌蒸馏水，使菌体充分振荡悬浮；在沸水浴中将菌悬液煮沸10 min，然后以转速11 000 r/min离心1 min，将上清液转移至另一新的灭菌离心管中，于-20℃条件下保存备用。

1.2.3 引物设计

研究选取Genebank中已经公布的沙门氏菌inv基因作为靶基因。

实时荧光LAMP所用引物见表1。

表1 实时荧光LAMP所用引物

1.2.4 RF-LAMP反应体系

总反应体系 （25 μL） 包括 2.5 μL 10×Bst buffer，1 μL镁离子（50 mmol），5 μLdNTPs（2.5 mmol）混合物，1 μLBst酶（8 000 U/mL），1 μL甜菜碱（5 mol），1.5 μL 模板 DNA，0.5 μL SYBR，FIP 和 BIP 引物（10 mmol）各2.5 μL，F3和B3引物（10 mmol）各0.5 μL，无菌双蒸水补足体积至 25 μL。扩增反应条件为61℃条件下反应1 h。

1.2.5 RF-LAMP的特异性

采用热裂解法对表1中15株菌进行基因组DNA提取。阴性对照用无菌蒸馏水代替模板。按照优化好的RF-LAMP反应体系进行扩增来验证该方法的特异性。

1.2.6 RF-LAMP检测纯菌的灵敏度

以编号为CMCC 50041的肠炎沙门氏菌作为试验菌种进行灵敏度和检出限的检测。将过夜培养的新鲜菌液进行平板菌落计数，测得菌液浓度为5.6×109CFU/mL。用无菌生理盐水对其进行10倍梯度稀释，得到连续稀释的肠炎沙门氏菌悬液。取1 mL各稀释梯度的菌悬液提取基因组DNA，并进行RFLAMP方法的灵敏度试验。

1.2.7 RF-LAMP检测人工污染肉制品的检出限

取25 g经国标法检测无沙门氏菌的肉制品加入到225 mL的无菌生理盐水中，制成匀浆液，取9 mL加到离心管（10 mL） 中，分别将10倍梯度稀释的菌悬液（5.1×107～5.1×102CFU/mL） 各1 mL加到上述离心管中，混匀，得到不同浓度的菌液匀浆。用1.2.2中所述热裂解法提取基因组DNA，并用RF-LAMP方法验证人工污染肉制品中沙门氏菌的检出限。

2 结果与分析

2.1 RF-LAMP的特异性

实时荧光LAMP引物特异性的检测结果见表2。

从表2中可以看出，用于RF-LAMP特异性试验的15株试验菌株中，4株沙门氏菌检测结果为阳性；其他11株非沙门氏菌检测结果为阴性，结果表明该研究建立的方法特异性强。

表2 实时荧光LAMP引物特异性的检测结果

2.2 RF-LAMP检测纯菌的灵敏度

实时荧光LAMP检测沙门氏菌的灵敏度见图1。

图1 实时荧光LAMP检测沙门氏菌的灵敏度

由图1可以看出，当沙门氏菌纯培养物浓度为5.6×105CFU/mL～5.6×101CFU/mL时，荧光曲线出现明显的扩增峰，仪器自动判定为阳性；当浓度为5.6×100CFU/mL时，荧光曲线平缓，未出现扩增峰，判定为阴性。因此，研究所建立RF-LAMP检测沙门氏菌的灵敏度为56 CFU/mL。

2.3 RF-LAMP检测人工污染肉制品的检出限

实时荧光LAMP法人工污染肉制品检出限的确定见图2。

从图2中可以看出，当沙门氏菌纯培养物浓度为5.6×107CFU/g～5.6×104CFU/g时，荧光曲线出现明显的扩增峰，仪器自动判定为阳性；当培养物浓度为5.6×103CFU/g时，荧光曲线平缓，未出现扩增峰，判定为阴性。因此，研究所建立RF-LAMP检测人工污染肉制品的检出限为5.6×104CFU/g。

图2 实时荧光LAMP法人工污染肉制品检出限的确定

3 结论

研究建立了一种RF-LAMP方法来快速检测沙门氏菌，检测灵敏度为56 CFU/mL，检测人工污染肉制品中沙门氏菌的检出限为5.6×104CFU/g。该方法是在LAMP技术的基础上，向体系中添加荧光染料，通过观察是否有峰图出现就可知道反应是否发生。与PCR方法相比，RF-LAMP可在等温条件下完成扩增，不需要昂贵的PCR仪；与传统LAMP相比，该方法的灵敏度更高，且避免了传统LAMP产生的气溶胶污染。该方法在结果出现后可直接终止反应，既节省时间又降低了试验成本，同时避免了繁琐的电泳。总之，该研究建立的RF-LAMP检测沙门氏菌方法特异性强、灵敏度高，为沙门氏菌的快速检测开辟了新途径，适合在基层检测机构推广应用。