基于锌离子螯合能力的玉米醇溶蛋白酶解条件优化及其抗氧化性

韩家文，朱蕊芳，李 丹，杨靖宇，杨 超

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

0 引言

玉米醇溶蛋白含有大量的含硫氨基酸和疏水氨基酸，同时国内外研究发现玉米蛋白肽具有降血压[1]、降血脂[2]、抗氧化[3]、抗疲劳[4]、增强免疫系统[5]及解酒精毒性[6]等多种活性功能，因而受到广泛关注。锌（Zn）是人体及其他动物体必需的微量营养素，锌的受重视程度等同于对铁营养素的重视[7]。为了提高微量营养素的摄入量，矿物质以盐的形式添加到强化食品中，可以改善微量元素的缺乏[8]。然而，该方法又受到低溶解性、氧化作用等诸多问题的限制。因此，以螯合的形式添加到食品中更可以提高矿物质的生物利用率。研究表明，特定的氨基酸（组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸），以及蛋白水解获得的生物活性肽等膳食组分，与金属离子螯合后，大大地提高了金属离子（Zn或Fe）的生物利用率[9]。

试验采用碱性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，以锌离子螯合能力为评价指标优化酶解条件，并评价了酶解物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基、羟自由基和ABTS+·清除能力，以期为今后锌补充剂和锌强化功能性食品在商业化生产及推广方面提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白（蛋白质含量为86.41%），上海麦克林生化科技有限公司提供；Alkaline proteinase，北京索莱宝科技有限公司提供；亮氨酸，Biosharp白鲨生物科技提供；十二烷基磺酸钠、氢氧化钠，均为分析纯；无水乙醇、六亚甲基四胺、硼酸、硼砂、磷酸二氢钾（均为分析纯），辽宁泉瑞试剂有限公司提供；硫酸锌、乙二胺四乙酸（均为分析纯），天津市河东区红岩试剂厂提供；OPA（98%）、二甲酚橙指示剂，Aladdin；β-巯基乙醇，南京森贝伽生物科技有限公司提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2- 联氮 - （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二铵盐自由基（2，2'-azinobis- （3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） free radical，ABTS+·），合肥博美生物科技有限责任公司提供。

THZ-82A型水浴恒温振荡器，常州润华电器有限公司产品；SPECORD 210 Plus型全自动紫外可见光谱仪，德国耶拿分析仪器股份公司产品；DELTA 320型pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解条件优化试验

选择底物质量浓度、酶添加量、酶解温度、酶解时间作为考查因素。底物质量浓度设置为10，20，30，40，50，60 mg/mL；酶添加量设置为 0.5×105，1×105，2×105，8×105，14×105，20×105U/mg；酶解温度设置为40，45，50，55，60，65℃；酶解时间设置为1，2，3，4，5，6 h。每个设计做3个平行样取其平均值进行计算分析。

1.2.2 指标的测定

采用邻苯二甲醛（OPA） 分光光度法测定游离氨基氮方法计算玉米醇溶蛋白的酶解度[10]。酶解度按公式（1） 进行计算。

式中：A——样品质量浓度，mg/mL；

hT——样品蛋白质的总肽键数，7.80 mmol/g。

锌离子螯合能力的测定参照Wang等人的方法，计算方法略有改动。用EDTA络合滴定法测定螯合态锌的含量。吸取20 mL锌肽螯合物于锥形瓶中，加2滴二甲酚橙指示剂（0.5%水溶液），滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺—盐酸缓冲溶液（pH值5.0） 至溶液呈稳定的紫色后加入4 mL缓冲液，用已标定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变成黄色，记录EDTA的消耗量。样品Zn2+螯合能力按公式（2） 计算。

式中：AP——沉淀中Zn2+含量，mg；

P——样品蛋白质含量，g。

1.2.3 抗氧化活性试验

（1）DPPH自由基清除效果测定。蛋白酶解物用去离子水溶解后配成质量浓度为1～6 mg/mL的溶液，备用。用95%乙醇溶液配制0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液，现用现配。取1 mL的样品溶液加入1 mL乙醇，再加入1 mL的DPPH自由基溶液于比色皿中，振荡混匀后在37℃水浴中避光反应0.5 h。于波长517 nm处测定吸光度A1。乙醇作为空白对照测定吸光度 A2，VC做阳性对照。按照公式 （3） 计算DPPH自由基清除率。

（2）羟自由基清除效果测定。分别向试管中加入0.5 mL水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL FeSO4溶液、0.5 mL样品溶液和1 mL H2O2溶液。混匀后在室温反应10 min，于波长510 nm处测定吸光A1。取0.5 mL蒸馏水代替FeSO4溶液，测得吸光度A2，取0.5 mL蒸馏水代替蛋白溶液，测得空白吸光度A0，VC做阳性对照。按照公式（4）计算羟自由基清除率。

（3） ABTS+·清除率的测定。ABTS溶液的配制：取0.1 g ABTS+·和0.029 g过硫酸钾溶于100 mL磷酸盐缓冲液，混合后于25℃下避光反应16 h备用，试验时取2 mL该反应液，加入18 mL磷酸盐缓冲液，配成ABTS+·储备液，避光保存当日备用。用磷酸盐缓冲液稀释ABTS+·储备液，于波长734 nm处测定吸光度在0.85左右，即为ABTS+·工作液，现用现配。

测定方法：分别取0.1 mL样品溶液，加入3.9 mL ABTS+·工作液，混匀。混合液室温静置10 min，于波长734 nm处测定吸光度A1，以试样溶剂代替样品溶液测定空白吸光度A0，以磷酸盐缓冲液代替ABTS+·工作液测得吸光度A2，试验平行3次，VC做阳性对照。按照公式（5） 计算ABTS+·清除率。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2007进行数据处理和作图，用SPSS 22.0软件进行正交试验设计与显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶解时间对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响

在底物质量浓度2 mg/mL，酶添加量1×105U/mg，酶解温度50℃，pH值12的条件下，选择不同的酶解时间。

酶解时间对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及水解度的影响见图1。

图1 酶解时间对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及解解度的影响

由图1可知，3 h之前，Zn2+螯合能力随着酶解时间延长逐渐增加，在3 h时Zn2+螯合能力达到最大5.92 mg/g，均显著高于2 h和4 h下的Zn2+螯合能力，因此最佳反应时间选择3 h。测定不同酶解时间下酶解产物的酶解度，酶解度呈现先上升后下降的趋势，反应进行3 h时，酶解度达到最高36.13%，随后趋于平缓，说明此时反应基本完成。

2.1.2 底物质量浓度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响

在pH值12，酶添加量1×105U/mg，酶解温度50℃的条件下，探究底物质量浓度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响。

底物质量浓度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响见图2。

图2 底物质量浓度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响

由图2可知，在底物质量浓度6～10 mg/mL，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力逐渐升高，当底物质量浓度为10 mg/mL时，Zn2+螯合能力为5.92 mg/g，达到最高，此时的酶解度为36.13%。随着底物质量浓度增大，玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度均缓慢降低，可能是因为底物质量浓度增大导致反应体系黏度增大，进而影响了分子运动速率，降低了Zn2+螯合能力及底物和酶切位点的结合。

2.1.3 酶添加量对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响

在底物质量浓度2 mg/mL，酶解温度50℃，pH值12，酶解时间5 h条件下，考查酶添加量对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响。

酶添加量对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度影响见图3。

图3 酶添加量对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度影响

由图3可知，随着酶添加量的增加，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力呈现先增加后降低的趋势，当酶添加量为2×105U/mg时，Zn2+螯合能力为9.36 mg/g，达到最高，此时的酶解度为15.55%。而后，随着酶添加量的增大，酶解度逐渐增加，而Zn2+螯合能力呈下降趋势，这可能是水解度太大，破坏了Zn2+与蛋白质结合位点的原因导致的。

2.1.4 酶解温度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响

在底物质量浓度2 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，pH值12，酶解时间5 h条件下，考查酶解温度对玉米醇溶蛋白Zn2+螯合能力及酶解度的影响。

酶解温度对玉米醇溶蛋白酶解度及Zn2+螯合能力影响见图4。

图4 酶解温度对玉米醇溶蛋白酶解度及Zn2+螯合能力影响

由图4可知，随着酶解温度升高，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力呈现先增加后降低的趋势，当酶解温度50℃时，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力为9.36 mg/mL，达到最大，此时酶解度为15.55%。酶解温度继续升高时，Zn2+螯合能力逐步下降，而酶解度继续升高，当酶解温度达60℃时，酶解度达到26.09%，随后下降。这一结果表明，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力及酶解度并不是呈正相关的关系。

根据以上单因素结果，在反应体系pH值12条件下，底物质量浓度10 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，酶解时间180 min，酶解温度50℃，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力最佳，达到9.36 mg/g。在最适条件下，利用碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白，制得玉米醇溶蛋白锌离子螯合物（ZA）备用。

2.2 玉米醇溶蛋白锌离子螯合物抗氧化能力

玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物DPPH自由基清除活性见图5。

图5 玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物DPPH自由基清除活性

由图5可知，随着ZA质量浓度增大，DPPH自由基清除率明显增强。质量浓度为8 mg/mL时，玉米醇溶蛋白对DPPH自由基清除率为52%，玉米醇溶蛋白锌离子螯合物对DPPH自由基清除率为76%，显著高于未反应的玉米醇溶蛋白（p＜0.05）。

羟自由基是一种危害较大的氧自由基，在生物体内能与蛋白质等物质发生反应并破坏其活性的能力。

玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物羟自由基清除活性见图6。

由图6可知，ZA与未反应的玉米醇溶蛋白清除羟自由基的能力随蛋白质质量浓度的增大而增大。质量浓度为6 mg/mL时，玉米醇溶蛋白的羟自由基清除率为36%，ZA的羟自由基清楚率为71%，远远高于反应前的玉米醇溶蛋白（p＜0.05）。

ABTS+·广泛用于样品的抗氧化能力测定，蛋白样品与ABTS自由基反应使其褪色，吸光度越低，表明样品的抗氧化能力越强。

玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物ABTS+·清除活性见图7。

图6 玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物羟自由基清除活性

图7 玉米醇溶蛋白及其锌离子螯合物ABTS+·清除活性

由图7可知，随着蛋白质质量浓度的增大，玉米醇溶蛋白与ZA对ABTS+·清除率均有增加。质量浓度为6 mg/mL时，玉米醇溶蛋白的ABTS+·清除率36%，ZA的ABTS+·清除率为 58%，表明 ZA的ABTS+·清除率更高一些。

综上所述，与玉米醇溶蛋白相比，玉米醇溶蛋白经碱性蛋白酶酶解后，其锌离子螯合物对DPPH自由基、羟自由基、ABTS+·清除能力均有不同程度的增加。

3 结论

以Zn2+螯合能力为考查指标，通过单因素试验，确定了碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的最佳条件为反应体系pH值12，底物质量浓度10 mg/mL，酶添加量2×105U/mg，酶解时间180 min，酶解温度50℃，玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力最佳，达到9.36 mg/g。在最适反应条件下酶解获得的玉米醇溶蛋白锌离子螯合肽，其DPPH自由基、羟自由基、ABTS+·的清除能力较未反应的玉米醇溶蛋白的有显著提高，表现出较好的抗氧化能力，为玉米醇溶蛋白的进一步加工提供参考。