小鼠痤疮模型研究进展

陈尔净，刘晓伟，卢 丹，黄敏敏，叶陈庚，黄学嵘，陈永欣，周艳平

(1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，南宁 530200； 2.广西中医药大学基础医学院生理学教研室，南宁 530200)

痤疮(acne)是一种由毛囊皮脂腺异常引起的慢性炎症性疾病，青少年对其应答率为80%[1-2]。严重的痤疮与社交障碍、生活质量下降、抑郁和自尊心下降有关[3]。痤疮是一种常见的疾病，其发病机制具有多因素、多态性的特点。目前，大部分研究认为痤疮的发病与角化细胞增生、神经肽P物质(substance P， SP)表达异常、雄激素水平升高、皮脂腺功能亢进、丙酸杆菌 (propionibacteriumacnes，P.acnes) 菌群异常诱导机体免疫反应和局部炎症的发生有关[4]。有研究表明，痤疮患者皮脂成分变化主要包括白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、CD3+和CD4+T细胞水平升高，早期亚临床痤疮病灶(微球蛋白)，脂肪酸比例升高[5-8]。小鼠痤疮模型是目前研究痤疮发病机制、临床抗痤药物的主要痤疮模型之一，与其他的动物相比，小鼠具有易饲养、实验成本低、容易获得等优点。本文旨在通过对近几年国内外的小鼠痤疮模型的建模方法、适用范围及优缺点进行简要归纳，以利于在痤疮发病机制、抗痤药物等相关研究中选择适合的小鼠模型。

1 P.acnes诱导模型

1.1 小鼠炎性痤疮模型

P.acnes是革兰阳性厌氧菌，是痤疮的主要病原菌。小鼠耳廓皮内注射P.acnes菌悬液造成小鼠耳部感染，可模拟P.acnes菌群异常而引起的痤疮外部表现及炎性反应，但痤疮丙酸杆菌灭活后则无类似反应[9]。小鼠体内有低浓度的甘油三酯(triglyceride，TG)，TG可被P.acnes脂肪酶分裂成甘油和脂肪酸，从而促进P.acnes生长[10]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)蛋白家族的模式识别受体已被鉴定为P.acnes应答受体，TLR2在P.acnes感染的角质形成细胞、单核细胞和巨噬细胞中的表达升高。TLR激活促进了促炎细胞因子、趋化因子、前列腺素和白三烯的产生[11-12]。P.acnes通过依赖于TLR2的途径诱导单核细胞因子的产生，还通过TRL2诱导白细胞介素-12(interleukin-12， IL-12)P40启动子活性的激活，诱导原代人单核细胞产生IL-12和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)。此外P.acnes还可通过生成多种酶类物质分泌大量活性产物，导致毛囊壁被破坏引起炎症反应[13]。因此，小鼠耳内注射P.acnes的模型可代表毛囊破裂后的肉芽肿型痤疮炎症。

用PBS缓冲液配置浓度为6×107cfu/μL的P.acnes菌悬液，并皮内注射到8周龄的雄性ICR小鼠的右耳，以诱导小鼠急性耳水肿，建立小鼠炎性痤疮模型[14]。该模型表观可见小鼠的耳部肿胀、发红和红斑，镜下病理表现为巨噬细胞、CD45+白细胞和Ly6G+中性粒细胞等浸润性炎症细胞的数量显著增加[15]。该模型可导致小鼠耳内局部细菌定植和炎症，这与人类痤疮病变相似，且因其简单方便、造模成功率高，常用于P.acnes导致痤疮的机制及抗P.acnes药物研究。然而小鼠鼠耳较小，建模过程容易贯穿鼠耳，这影响了对模型的表面观察及鼠耳厚度检测。另外有研究表明，小鼠耳朵炎症反应引起的继发性改变是有限的，在小鼠背侧注射P.acnes更容易观察炎症性痤疮的初始过程[16]。

1.2 小鼠人造皮脂痤疮模型

小鼠人造皮脂痤疮模型是通过联合应用P.acnes接种和局部应用与人皮脂成分极为相似的人造皮脂建立的小鼠痤疮模型。人体皮肤的所有部位，除了手掌和足底部位外，都含有皮脂腺，并被皮脂膜覆盖，且该皮脂膜主要由角鲨烯、蜡单酯、TG和脂肪酸组成。提前24 h剃除注射部位的鼠毛。实验当天，通过混合脂肪酸、TG、25%蜡单酯和角鲨烯制备人造皮脂，再向8周龄的CD-1雌性小鼠背部皮内注射约50 μL浓度为1×107cfu/μL的P.acnes的菌液，注射后立即在小鼠注射部位涂抹20 μL新鲜人造皮脂，并每天重新涂抹，持续7 d[17-18]。人造皮脂可促进皮内注射P.acnes的痤疮模型持续存在1周。此外，角鲨烯也大量存在于人皮脂中，且人类面部和背部的皮脂浓度最高，但不存在于小鼠皮脂中，并且角鲨烯在支持痤疮生长中的作用尚不清楚[19]。人造皮脂与P.acnes的联合应用可促进痤疮病理学的再现性和显著性，但皮脂本身对皮肤病理学没有影响[18]。然而，人造皮脂的不稳定性及价格较贵，限制其在实验中的应用。

1.3 生物工程人化痤疮微环境模型

生物工程人化痤疮微环境模型(bioengineering a humanized acne microenvironment model)是将真皮细胞捕获系统(dermis-based cell-trapped system，DBCTS)作为支架与组织腔结合使用，利用P.acnes诱导小鼠发生免疫反应的小鼠痤疮模型。

利用DBCTS捕获人皮脂细胞，并将捕获的人皮脂细胞插入组织腔用以模拟皮脂腺。将含有人皮脂细胞的无菌组织腔皮下植入ICR小鼠腹部皮肤7 d后，以确保在皮下环境中完全被小鼠组织包裹；再将20 mL浓度为107cfu/mL 的P.acnes菌悬液注射到组织腔中诱导宿主免疫反应，用于模拟体内细菌感染[20-22]。人皮脂细胞包裹的DBCTS在小鼠体内创造了一种人化痤疮微环境模型，含有细胞释放的蛋白质的组织间充质液可用于研究P.acnes、人皮脂细胞和小鼠免疫细胞之间的相互作用[23]。最重要的是，该模型可突破小鼠不能产生抗胸腺依赖性抗原的抗体的局限，用于筛选新的抗痤疮药物和疫苗[20]。然而人皮脂细胞的捕获、组织腔植入等因素使造模重复性低、造模较慢，故其造模方法仍需加以改进。

2 化学药物刺激诱导模型

2.1 二甲苯诱导模型

二甲苯(xylene)是一种致敏剂和芳香刺激剂，在研究抗痤药物的抗炎作用中被广泛应用。二甲苯的伤害作用主要是由瞬时受体电位香草酸亚型(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)受体激活介导的，但TRPV1不参与炎症诱导作用，而是由SP通过激活血管内皮细胞上的速激肽NK1受体诱导血浆蛋白外渗，而降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)则诱发血管舒张，并增强SP在神经支配区的促炎作用。此外，皮肤中的有机溶剂产生的活性氧和/或羰基物质(carbonyl species)通过激活辣椒素敏感神经末梢膜上的TRPV1通道参与炎症反应[24]。

将0.03 mL二甲苯注射入成年雄性BALB/C小鼠右耳前后叶，以诱导小鼠急性耳水肿，建立小鼠炎性痤疮模型[25]。由于炎症反应激活引起的小鼠耳水肿使鼠耳重显著增加，特征是疼痛、发热、发红和肿胀[26-27]。在组织病理学上，可检测到严重的血管扩张、皮肤水肿的改变和炎症细胞的浸润、血浆蛋白外渗。二甲苯诱导小鼠炎性痤疮模型建模快、重复性高，但只能反映急性炎症早期阶段的水肿化，因此该模型常通过评价血管通透性以研究抗痤药物在体内的抗炎作用。

2.2 巴豆油诱导模型

巴豆油中含有佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA)。TPA通过激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，包括P38有丝分裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)和核因子kB(nuclear factor-κB, NF-κB)，以及生成白细胞介素、角蛋白细胞衍生趋化因子等介质，激活诱导磷脂酶A2酶促作用而发生炎症，从而形成花生四烯酸代谢产物，如缓激肽、白三烯、前列腺素、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等促炎因子水平升高，以模拟痤疮炎症[28-30]。

通过在瑞士种雄性小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油，以诱导小鼠急性水肿，建立小鼠炎性痤疮模型；通过每隔24 h在小鼠右耳涂抹20 μL 5%巴豆油诱导水肿，持续时间为9 d，以诱导小鼠慢性水肿，建立小鼠炎性痤疮模型[31]。组织学检测可见中性粒细胞和多形核白细胞的浸润、组胺和血清素的释放以及血管通透性随着水肿的形成而增加。巴豆油单次应用可提供抗痤药物在急性炎症过程中抗水肿活性的数据，而巴豆油多次应用可用于评估抗痤药物慢性炎症过程中的抗水肿活性，但巴豆油具有毒性，建模过程中应注意防护。

2.3 角叉菜胶诱导模型

角叉菜胶(carrageenan，CG)是一种强化学物质，用于刺激释放炎症和促炎介质(包括前列腺素、白三烯、组胺、血清素、缓激肽和TNF-α)。炎症的初始阶段(0～1 h)是由组胺、5-羟色胺和缓激肽释放引起的[32]。CG注射到后爪中可诱导进行性水肿在3 h内炎症指数达到峰值，注射后3 h，被炎症级联的一些抑制分子调节，炎症在24～72 h内消退[33]。CG引起的急性炎症反应以液体和血浆蛋白渗出为特征[34]。小鼠足跖皮下注射CG后，由于前驱炎症因子释放在爪子组织的作用，小鼠足趾出现水肿、痛觉过敏和红肿。通过将30 μL 浓度为1% 的CG注射KM种小鼠足底，以诱导小鼠足肿胀，建立小鼠炎性痤疮模型[35]。该模型具有高度的重复性，常用于研究与炎性痤疮相关的吞噬细胞浸润和自由基产生过量以及如TNF-α、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和诱导型一氧化氮合酶等炎症介质释放的炎症阶段[36]。

2.4 2,4-二硝基氯苯诱导模型

2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene，DNCB)是一种环己酰亚胺苯，DCNB可通过产生过敏原特异性抗体的I型超敏反应诱导体液免疫反应[46]。小鼠皮肤暴露于DNCB可由皮肤固有免疫的激活引起致敏阶段，以模拟痤疮炎症中因固有免疫引起的炎症反应[38]。

在实验前24 h，剃除5周或6周龄的BALB/C种雌性小鼠的背毛。在第0天和第4天，用无菌涂药器将100 μL 1%DNCB涂抹在小鼠剃毛区域，以建立小鼠痤疮模型。实验阶段，用涂药器将100 μL 0.2% DNCB涂抹至小鼠剃毛区域，每周两次，持续3周，以维持该模型[39]。此外，也可将1% DNCB涂抹于小鼠耳部建立小鼠痤疮模型[40]。在小鼠背侧皮肤上反复应用涂抹DNCB后，可出现红疹、结痂和免疫器官水肿，血清CD4+和CD8+值升高，胸腺指数、脾指数有明显升高[41-42]。DNCB致敏通常被用作诱导细胞介导免疫的方法，该模型常用以研究抗痤药物对痤疮中的免疫性炎症反应的干预作用。

3 雄激素诱导模型

雄激素(androgen)是所有调节皮脂分泌的激素中最重要，可刺激皮脂的产生和痤疮的形成。皮肤中的雄激素的局部过量分泌和/或雄激素受体的高表达，通过过氧化物酶体增殖物激活受体-C受体来调节表皮生长和脂肪细胞分化，而导致皮脂细胞和角质形成细胞的增值/分化，促使痤疮形成。皮脂的雄激素依赖性分泌由睾酮(testosterone，T)、二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)等雄激素介导。T主要通过局部转化为DHT通过1型5α-还原酶影响皮脂腺[43]。小鼠雄激素代谢酶活性升高，可使DHT增多，导致皮脂腺增生[44]。

对SPF级KM种雄性小鼠隔日肌肉注射丙酸睾酮0.1 mL，造模时间持续14 d，建立小鼠痤疮模型[45]。结果显示，小鼠血清睾酮、精囊腺指数、前列腺指数均明显升高。该模型常用于评价抗痤药物对雄激素分泌调控效应。此外，还可以将人面部全厚皮肤移植到成年雄性CD-1裸鼠上。移植4周后，通过植入充满T或DHT的导管给裸鼠注射雄激素，建立人皮脂腺的小鼠痤疮模型。在人面部全厚皮肤移植到成年雄性裸鼠前至少阉割1周，以进一步控制影响皮肤移植的内分泌环境。该模型可以研究雄激素导致痤疮的机制，也可用于研究抗痤药物对雄激素水平异常造成痤疮的疗效[46]。

4 结语

目前，小鼠痤疮模型的造模方式多由家兔、大鼠等痤疮动物模型改进而来，虽然从痤疮临床病症特点吻合度与症状模拟特点观察而言，小鼠模型相对不具优势，但小鼠模型在P.acnes定植与炎症方面优于家兔。而具有重复性好、造模快、成本低、易获得性更高的小鼠痤疮模型在大规模抗痤药物筛选中比大鼠痤疮模型更具优势。不同的小鼠痤疮模型具有不同的研究用途，因痤疮发病机制的复杂性，并没有一种小鼠痤疮模型能够完全模拟人类痤疮的临床表现和病理、生化变化。小鼠痤疮模型难以模拟痤疮的黑头粉刺症状，而家兔模型、墨西哥无毛犬模型则可模拟，因此痤疮模型的联合应用有利于提高痤疮研究的可信度。利用生物工程的方法使小鼠痤疮模型能够从多方面反映痤疮的表现的急性/慢性小鼠痤疮模型是其研究方向。炎症是痤疮模型的核心，对痤疮炎症因子抑制剂的靶向研究是痤疮治疗的新方向，而建立一个完善的炎性痤疮小鼠模型对于研究痤疮的防治具有重大意义。此外，不同的小鼠品种表现出反映人类痤疮早期炎症反应的变化的能力不同，HR-1小鼠更适合于建立炎性痤疮小鼠模型[16]。完善小鼠痤疮模型将推动痤疮发病机制和抗痤药物的研究，此必对人类攻克痤疮难题具有重要意义。