代谢组与肾细胞癌的早期诊断

王 站，张玉石

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院泌尿外科，北京 100730

肾细胞癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占成年男性全身恶性肿瘤的5%，成年女性的3%[1]。在世界范围内，发达国家的肾癌发病率要比发展中国家高，其中欧洲及北美占据了发达国家新发病例的70%以上[2]。在美国，2017年泌尿系肿瘤的新发病例约为146 650例，其中肾癌约63 990例，仅次于膀胱癌的79 030例[1]。在我国，肾细胞癌发病率在泌尿系恶性肿瘤中居第2位，且各地区肾癌发病率及死亡率差异较大，呈现出城市高于农村，男性高于女性的总体情况[3]。最新流行病学研究发现，我国2014年肾癌新发病例数约为68 000例，其中死亡病例数约为26 000例[3]。早期肾癌往往无特异性临床表现，目前尚缺乏有效的早期筛查手段。代谢组学通过筛选机体的内源性代谢产物，有望在肾癌肿瘤标志物的探测领域取得突破。

肾细胞癌的早期诊断与代谢组

早期肾癌常缺乏特异性临床表现，当患者出现典型的血尿、腰痛、腹部肿块而就诊时，往往已经处于肿瘤晚期。约20%～40%有上述症状的患者在就诊时已经处于晚期阶段，甚至已经发生远处转移，而伴发远处转移者预后较差，5年生存率在10%以下[4-5]。影像学检查虽然能够早期发现肾脏肿物，但对于肿物的良恶性鉴别效果欠佳；肿物穿刺活检术由于有创、检出率低且存在针道转移的风险，临床上的使用亦受到限制。因而，为了提高肾癌的早期诊断和治疗水平、降低肾癌的死亡率，无创、经济且具有良好敏感性和特异性的肿瘤标志物亟待产生。越来越多的研究表明，代谢通路的改变在恶性肿瘤，尤其是肾细胞癌的生物学行为中起着关键作用[6]。作为“组学”的一门新兴学科，代谢组学在肿瘤标志物的探测领域获得了极大关注。

代谢组学是20世纪90年代末期发展起来的，研究关于生物体系(细胞、组织或生物个体)受到外部刺激(比如外部环境因素变化或基因改变)后，其内源性代谢产物的种类、数量变化及其规律的科学。与基因组学、转录组学和蛋白组学不同，代谢组学主要的研究对象为相对分子质量小于1000的内源性小分子物质。这些小分子物质往往能够更加准确、全面地反映机体的病生理状态。通过代谢组学技术，寻找肾癌的差异性代谢组，将有助于发现新的肾癌肿瘤标志物。目前代谢组学常用的技术有气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术等。

肾细胞癌肿瘤标志物的代谢组研究进展

糖代谢根据Warburg效应，即使氧供充分，肿瘤细胞依然会选择无氧酵解来满足自身的代谢及增殖所需，因此肿瘤代谢途径的改变往往会导致相应代谢产物的异常[7]，这种改变会在肾癌组织、患者的血液及尿液中有所体现，这也为瘤标的寻找提供了理论基础。

葡萄糖：作为糖代谢的重要起始底物，葡萄糖是细胞代谢及增殖所需的重要能量来源。Cuperlovic-Culf等[8]通过离体培养发现，VHL-的肾癌细胞系无论是细胞内还是细胞外，葡萄糖浓度都发生了明显下降，且同时伴随着乳酸升高，而VHL+肾癌细胞系内糖浓度和氨基酸、三羧酸循环中间产物以及胆碱浓度密切相关，该结果不仅证实了Warburg效应，还提示葡萄糖是肾癌细胞重要的碳源。通过对离体肿瘤组织的分析，研究者发现肾癌组织局部血糖明显升高，这为肿瘤的高代谢状态提供了必要条件[6，9]。此外，肿瘤细胞对于葡萄糖的高摄取及高利用还会导致血清葡萄糖浓度的降低[10-11]。然而有研究显示，肾癌组和对照组的血清葡萄糖水平并未呈现出明显差异[12]，这可能与机体血糖的调控有关。目前仅有少量研究表明，肾癌患者尿液中的糖水平(主要是葡萄糖和乳糖)有所升高[13-14]。

丙酮酸：作为糖的有氧氧化和无氧酵解的分界点，丙酮酸浓度的改变有着重要意义。目前研究表明，M2型丙酮酸激酶主要表达于肿瘤细胞中，加速了磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的转化，导致在肾癌组织、癌细胞系、患者的血液及尿液中，丙酮酸的浓度都有所升高[11，13-17]，为瘤细胞的无氧酵解提供了丰富的前体物质。

乳酸：乳酸是无氧酵解的产物，也是肿瘤细胞遵循Warburg效应的具体表现。研究表明，在肾癌组织以及患者的血液、尿液中，乳酸浓度均明显升高[10-11，13，17-18]，其可能是肾癌的潜在肿瘤标志物，但鉴于几乎所有恶性肿瘤的无氧酵解途径都增强，因此乳酸作为肾癌肿瘤标志物的特异性较低。

山梨醇：山梨醇是葡萄糖多元醇途径的代谢产物，在调节肾髓质局部渗透压方面有一定作用。Leuthold等[9]通过多种质谱学技术发现，肾癌组织中乳糖、山梨醇等有所升高，催化磷酸戊糖途径相关酶系的活性也明显增强，这说明肾癌组织的磷酸戊糖途径发生上调。此外有少量研究表明，尿中山梨醇浓度亦明显升高，其具体机制有待进一步研究[12]。

三羧酸循环有研究显示，肾癌组织中三羧酸循环出现下调，这是肿瘤细胞有氧氧化受到抑制的表现[6-7，15]。肾癌患者血液、尿液中柠檬酸盐浓度较正常人明显下降，此现象与肿瘤需要更高的柠檬酸来产生乙酰辅酶a有关，而后者是脂肪代谢的重要底物[13-14]。此外，三羧酸循环的重要中间产物，如琥珀酸、苹果酸、延胡索酸等，在肾癌组织中都出现明显下降，说明肿瘤细胞的三羧酸循环受到明显抑制[15]。

氨基酸代谢研究发现，肾癌患者血清中谷氨酸盐浓度上升，但谷氨酰胺水平却下降[11-12，14-15]，该变化与谷氨酰胺酶活性的改变关系密切。而癌组织内谷氨酸盐和谷氨酰胺浓度的增加则促进了谷胱甘肽的生成，进而提高了癌细胞的抗氧化能力[7，9，15，19]。甘氨酸作为体内重要的一碳单位来源参与核酸的合成，研究发现肾癌患者血清中甘氨酸浓度较高，但尿液中甘氨酸却有所下降，这提示甘氨酸的改变与肿瘤细胞的核酸合成增加有关，但也可能与肿瘤引起的肾功能下降有关[18，20]。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等在肾癌患者血清中有所增加，但在癌组织中的浓度却明显降低，这可能与肾组织的三羧酸循环受到抑制，进而导致琥珀酰辅酶A含量减少有关[11-12，15，18]。龙胆酸由体内苯甲酸羟化而来，其在防止脂蛋白氧化方面具有重要作用，高浓度的龙胆酸对于预防癌细胞的细胞膜和细胞器过度氧化至关重要，而尿液中龙胆酸浓度的降低则提示着肿瘤对于该物质的高摄取和高利用[21]。牛磺酸由体内的含硫氨基酸经过一系列酶促反应而生成，是机体重要的抗氧化物，肾癌局部高浓度牛磺酸能够预防癌细胞快速分裂所造成的氧化应激损伤[15]。羟基喹啉铜位于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的上游，后者是糖酵解过程中重要的辅助因子。肾癌组织及尿液中羟基喹啉铜的增加，提示无氧酵解增强[7，21-22]。此外，羟基喹啉铜还与色氨酸及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢通路有关，意味着其可能参与了肿瘤的多条代谢通路[21]。多项代谢组学研究显示，癌组织内氧脯氨酸较癌周正常组织有所升高，而苯甲酰氨基乙酸(马尿酸)有所降低[6，9]。在肾癌患者的尿液中研究者还发现，马尿酸、3羟基丁酸酯均明显下降，提示肿瘤细胞可能过多利用了这些氨基酸，但也有可能受患者的饮食习惯、生活方式、并发疾病等因素影响[6，13，20]。

脂质代谢肿瘤细胞的三羧酸循环受到抑制，导致脂肪酸的β-氧化作为一条能量供应的选择通路而被激活[23]。对患者血液及肿瘤组织的磁共振波谱学检测发现，肾癌患者血浆脂肪酸水平较健康对照组略有下降，但肾癌组织的胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸及三酰甘油较对照组有所升高，显示了肿瘤对于脂质的富集作用[10，24]。有研究在肾癌组织及尿液中检测到左旋肉碱、酰基肉碱及乙酰肉碱浓度均明显升高[7，23，25]，离体实验显示上述物质多是肿瘤来源的[23]，说明肾癌患者的脂代谢发生上调。然而有研究发现，肾癌组织中脂肪酸β-氧化的大部分酶系出现下调，说明肾癌细胞可能并不依赖于脂肪酸β-氧化来获取能量[7]。已知胆碱和磷脂酰胆碱与细胞膜的合成密切相关。研究发现，肾癌患者血清的胆碱和磷脂酰胆碱较正常人有所下降[11，18]，但癌组织的胆碱和磷脂酰胆碱水平相比于瘤周正常肾组织却有明显升高[15]。进一步研究显示，该结果是由于肿瘤组织内溶血磷脂酰基转移酶表达上调造成的[26]，高胆碱的环境为肿瘤的快速增殖提供了必要条件，也提示胆碱是潜在的肾癌肿瘤标志物。

维生素代谢和瘤周组织相比，α-生育酚在肾癌组织中的含量有所升高[6，19]。α-生育酚的增加可能是机体对于脂类利用增加的一个表象，亦可能是肿瘤对抗氧化应激的需要。但有研究指出，在其他恶性肿瘤如卵巢癌组织中，α-生育酚的含量也有所升高，因此，其作为肾癌肿瘤标志物的特异性仍有待进一步证实[27]。

其他研究发现，尿液中由21种挥发性有机化合物构成的组合可以有效区分肾癌组和非肾癌组，其中的2-氧丙醛和2，5，8-三甲基-1，2，3，4-四氢萘-烯-1-醇在肾癌组和非肾癌组的改变最为明显，然而这两种有机化合物尚不能独立地作为肾癌的肿瘤标志物[28]。

前景和展望

目前虽然在基础研究中发现肾细胞癌的各种潜在瘤标，但均未能广泛应用于临床，其原因有以下几方面：(1)目前各中心研究的样本量较小，难以排除偶然因素的影响，且受限于技术和样本制备的差异，各实验室所得出的结果也不尽相同。(2)机体代谢组受多种复杂因素的影响，因此代谢组的异常能否反映肿瘤真实的代谢情况，目前仍值得商榷。(3)由于代谢通路存在交叉，因此终末分子的变化往往并不能反映特定通路的改变，这为瘤标的寻找及探索肿瘤病生理的改变增加了困难。然而，越来越多的研究表明，代谢组的异常和肾癌，尤其是肾透明细胞癌的关系极为密切。与基因组学和转录组学一样，代谢组学同样能够揭示肿瘤发生发展的病生理机制，进而为肾癌的早期诊断提供依据，为药物治疗提供新的靶点。随着技术的成熟、研究的深入、样本量的扩大以及多组学技术的应用，肾癌的代谢机制必将会更加清楚，适合于临床应用的肿瘤标志物终将会被挖掘出来。