冷诱导RNA结合蛋白生物学功能的研究进展

陈灵修 王世波

(重庆三峡中心医院呼吸内科，重庆404000)

1 CIRP的发现及分子结构

CIRP最早是在1997年由Nishiyama等[1]在研究基因转录过程中发现，并在小鼠睾丸细胞中分离鉴定。研究学者又在小鼠、非洲爪蟾、大鼠、墨西哥美西螈、牛蛙、鲑鱼等多种生物细胞中发现了CIRP的表达。人CIRP基因定位于第19号染色体p13.3位点上，人和大鼠的GenBank/EMBL/DDBJ 序列号分别是D78135[2]和AB0062[3]。

CIRP由172个氨基酸残基组成，分子量约18 kD。其核酸结构和氨基酸结构都高度保守,具有较高同源性，属于RNA结合蛋白异源核糖核蛋白hnRNP a18。CIRP蛋白有氨基末端的共有序列RNA识别区(RNA recognition motify,RRM)和羧基末端的甘氨酸富含区重复序列(Glycine-richdomain,GRD)。前者包含两个高度保守的核糖核蛋白序列：一个为八聚体(核糖核蛋白1，RNP1)；另一个为六聚体(核糖核蛋白2，RNP2)，其序列分别为：(K/R)G(F/Y)(G/A)FVX(FY)and(L/I)(F/Y)(V/I)(G/K)(G/N)L[4]，此区域与转录后调控有关。后者是一段重复出现的精氨酸-甘氨酸-甘氨酸重复序列[5]，目前对其功能尚不了解，推测其可能参与了CIRP胞内定位及与其他蛋白质的相互作用。

2 CIRP的表达及定位

CIRP作为一种RNA结合蛋白，可以在多种细胞及多个器官中表达，且其表达在应激原的作用下升高或降低。如Nishiyama等[6]在K562、NEC8、HepG2、HeLa、T24和NC65细胞中发现了CIRP的表达；Danno等[7]检测了常温下人体胰腺、甲状腺、肾上腺、睾丸和胎盘细胞中CIRP的表达情况，结果显示CIRP在上述细胞中均有少量表达；Xue等[2]在大鼠脑、肺脏、肝脏、肾脏、结肠、胃等器官中CIRP于常温有低水平表达。不仅如此，CIRP的表达强度与温度密切相关，降低温度可使其表达增加[8]，而升高温度则导致其表达降低[9]。据研究，CIRP的表达与动物冬眠有密切关系(CIRP在冬季表达水平明显升高，反之在夏季表达量则明显降低，这恰好与动物冬眠的时期相对)[10]，阴囊的温热环境亦可降低CIRP表达水平并影响小鼠精子DNA的完整性[11]。

CIRP最初是Nishiyama等[1]在人和小鼠多种细胞核中被检测发现的。而Matsumoto等[3]在非洲爪蟾卵母细胞质中也检测到了CIRP的表达。此外，研究者在人精子细胞的胞质中也检测到了CIRP的表达[12]，且发现在结肠癌 RKO 细胞株中，CIRP在紫外线照射条件下从细胞核转位到了细胞质。有研究也证实在应激原的刺激下，CIRP在其精氨酸甲基化的作用支配下，被诱导出核并在细胞质中积累[13]。综上我们推测CIRP的细胞定位不是固定的，而是取决于细胞类型及细胞状态。

3 CIRP与应激反应

应激反应是一种全身性的、复杂的适应性反应，具体指机体在受到强烈有害刺激时，所产生的交感神经兴奋、丘脑下部-脑垂体-肾上腺皮质系统活动增强等一系列神经内分泌改变。适当的应激对机体而言具有适应性的保护意义。不过，过度的应激反应对动物体也会造成损伤，即所谓的适应性疾病(如应激性溃疡、应激性糖尿病等)。因此深入研究应激反应的发生、发展及相关调控机制，促使机体能够在有效进行保护性应激的同时，最大限度降低其病理性应激所带来的伤害，无疑对人们的日常生活及临床患者的治疗均具有一定的指导意义。迄今为止，多项研究表明，众多环境因素可上调CIRP的表达，并且过表达的CIRP在低温[14]、缺氧[15]、紫外线[16]、高渗[17]等应激条件下发挥了重要的细胞保护作用。

3.1CIRP与低温应激 CIRP作为一种应激反应蛋白，伴随着多种生物应激条件过量表达，而冷应激是第一个被发现能诱导CIRP过表达的应激条件[18]。研究证实CIRP的表达强度与低温高度密切相关，小鼠CIRP 基因表达水平在温和冷刺激下(32～18℃)其表达呈低温依赖性，即随温度的降低其表达逐渐升高,相反其表达水平在热处理(39℃或42℃)条件下明显降低[8]。研究者通过体外细胞培养(K562、NC65 、HepG2 等细胞系)，CIRP在冷应激后1～3 h被检测发现，12 h表达水平达高峰，据此推测CIRP可能是亚低温环境中最早的应激产物，在冷应激反应过程中发挥着重要作用。这一论断被后续研究证实：CIRP在低温环境下不仅可抑制环已酞亚胺和TNF-γ介导的细胞凋亡[14]，还能有效抑制H2O2诱导的神经元细胞凋亡[19]。此外，大肠杆菌对低温的适应能力被来源于拟南芥的 CIRP蛋白显著提高[20]。这充分表明CIRP在冷应激过程中扮演了积极有利的角色。

3.2CIRP与缺氧应激 在海平面自然状态下，平静呼吸氧浓度为21%的空气时，机体不同组织的氧含量具有明显异质性[21]。与正常氧含量相比，缺氧可诱发多种急慢性损伤、甚至疾病(包括肿瘤)[22]。既往研究发现，低氧调控的mRNA与低温调控的mRNA具有相同的组成元件，即内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)。当外界刺激因素发生变化时，绝大部分蛋白的mRNA翻译水平和翻译效率受到抑制，然而含有IRES元件的mRNA翻译仍可以有效且高效进行[23]。此外，Wellmann等[24]发现CIRP的基因序列中含有低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)共有序列结合位点。并且，低氧环境可通过线粒体依赖机制和HIF-1不依赖机制诱导CIRP的表达。相反，Zhang等[25]利用神经干细胞建立缺血缺氧模型发现轻度低氧(8%)可通过上调ROS进一步诱导CIRP的高表达，而重度缺氧(1%)却由于超载的ROS抑制了CIRP的表达引起细胞周期停滞，进而阻断了神经干细胞的增殖。综上，我们推测低氧调节的CIRP表达呈剂量依赖性。

3.3CIRP与紫外线及渗透压应激 大量研究证实CIRP在紫外线(UV)照射和高渗透压环境下发挥着细胞保护效应[12,23]。 具体机制如下：当细胞受到UV损伤后，CIRP的C-端发生甲基化从细胞核运动至细胞质，并绑定靶向mRNA的3′UTR，通过与翻译元件的相互作用来参与DNA的损伤修复、转录后调节及增加蛋白质翻译，从而发挥细胞保护作用。

3.4CIRP与其他应激 除上述因素外，毒素和药物也能促进CIRP的表达。如神经毒素多糖酸可诱导小鼠大脑CIRP的表达[26]，LPS可上调鱼体内CIRP mRNA表达[27]。此外，研究表明纤维素样生长因子21(FGF21)和胰岛素样生长因子(IGF-1)对CIRP和RBM3的表达也有一定促进作用[28,29]。

4 CIRP的生物学功能与疾病

4.1CIRP与生物节律 1998年，Nishiyama等[9]检测了小鼠脑中CIRP蛋白24 h内的表达情况，结果显示不同时间的CIRP呈现不同表达趋势：下午6点其表达量最高，下午6点至凌晨3点其表达量逐渐降低，随后又慢慢回升。总体表明CIRP的表达存在昼夜节律，即白天表达升高，夜间开始下降。2012年，Morf等[30]将CIRP和CLOCK基因定义为“昼夜节律基因”，并揭示了其在体温节律性变动影响下表达的分子机制：温度变化引起CIRP的节律性表达，编码不同昼夜节律调节器蛋白的RNA通过与CIRP结合，以此增强自身的稳定性，并提高自身翻译效率。此外，Bellesi等[31]及Nikonova等[32]对机体睡眠和觉醒状态下基因表达情况进行相关研究，均发现CIRP在睡眠相表达明显上调，而在觉醒状态表达显著降低。综上，我们推测CIRP在动物昼夜节律、睡眠/觉醒周期等生物节律的调节过程中发挥重要作用。

4.2CIRP与生殖 CIRP蛋白最初是由Nishiyama等[1]在睾丸细胞中发现的，且在进一步研究中发现CIRP在初级精母细胞中呈现过量表达，热处理6 h后其表达下降，提示CIRP在初级精母细胞中具有特殊作用。Banks等[33]也发现了阴囊的温热环境在下调CIRP的表达，同时影响小鼠精子DNA的完整性，进一步提示在精子的发生过程中CIRP具有非常重要的作用。因此我们研究不同温度下睾丸中CIRP的表达状况将有助于阐明雄性不育的分子机制。

4.3CIRP与胚胎发育 尽管我们对CIRP在胚胎发育期间所起的作用还不十分了解,但是早前研究已经证实CIRP存在于两栖动物卵母细胞质中[3],后来又被精确定位于假定的神经组织和原肾(两栖动物幼虫时期的最初级排泄器官)或胚肾内，且在原肠胚期表达量快速增加。2006年，Peng等[34]研究证实，在非洲爪蟾胚胎发育期间,CIRP参与了其原肾特化和胚胎细胞移行过程。这提示CIRP可能在动物胚胎发育过程中起着重要作用。

4.4CIRP与脑部疾病 CIRP在低温中的神经保护作用已被肯定。诸多研究证实亚低温不仅在急性缺血性疾病[35]和外伤性脊髓损伤[36]中有效降低原发损伤，积极抑制其带来的二次伤害，而且在慢性神经退行性疾病[37]延缓其疾病进程。研究者通过体外培养原代神经细胞和嗜铬细胞瘤PC12细胞株，发现低温诱导的CIRP过表达具有抗细胞凋亡的作用[39]。

然而，CIRP在缺血性脑损伤中的作用却存在争议。早期，在大鼠脑缺血-再灌注模型中[2]，研究者利用原位杂交、免疫组化等方法发现再灌注后3～6 h，海马中CIRP mRNA表达明显减少，大脑皮质中的CIRP mRNA即使灌注后48 h也无明显变化；然而在同样的大鼠脑缺血-再灌注模型中，Liu等[40]利用real-time PCR法检测发现在大鼠皮层脑缺血后24 h，CIRP mRNA逐渐增加至5倍；与局部缺血相比，低温处理24 h后，CIRP mRNA的表达增至30倍，而低温和缺血共同刺激下，CIRP mRNA的表达亦不超过30倍；另在32℃低温条件下培养的PC12细胞中，CIRP mRNA表量显著增加；这种CIRP的过表达现象可因培养液中外加H2O2而呈剂量依赖性抑制。此外，大量研究证明，脑缺血后产生的过量ROS(H2O2的代谢产物)可致脑损伤加重[41]，而H2O2下调CIRP表达可能是ROS引起脑损伤的作用机制之一。当内源性CIRP合成增多或人为上调的表达可显著抑制H2O2引起的神经细胞凋亡[42]。这些结果充分说明CIRP具有神经保护作用。但后续研究发现释放入循环系统的CIRP蛋白与损伤性免疫应答密切相关。Zhou等[43]通过体内外实验发现，脑缺血后小脑胶质细胞分泌的CIRP可通过介导的TNF-α表达导致神经炎症，并引起神经元损伤。另研究者在小鼠酒精诱导大脑炎症模型中也发现酒精可促进小脑胶质细胞CIRP的表达及分泌，通过上调炎症因子TNF-α和IL-1β诱发神经炎症[44]。这些研究结果提示CIRP在大脑缺血再灌注损伤中存在保护和加重损伤的双重功能：一方面，只要CIRP存留于细胞内，其可抑制损伤引起的神经细胞凋亡；另一方面，一旦CIRP被释放入血则可引起严重的神经炎症反应。

4.5CIRP与肿瘤 既往研究发现，在肝细胞肝癌(HCC)中，CIRP通过介导ROS的累积和肿瘤干/祖细胞的扩增促进肿瘤的发生，且HCC复发风险与肝脏CIRP表达呈正相关[45]；在结肠直肠肿瘤中，CIRP通过刺激细胞因子(包括TNF-α和IL-23)的生成来调节肿瘤和慢性炎症的发生[46]；在垂体腺瘤中，过量表达的CIRP可能通过ERK1/2介导肿瘤细胞的增殖、浸润和复发[47,48]；在口腔鳞状细胞癌中，CIRP与TLR4的过量表达，与该肿瘤存活率低有关[49]；CIRP还可通过增加细胞周期调节因子CyclinE1(一种重要的细胞周期调节因子)的表达，促进导管癌向浸润性乳腺癌的发展。此外，CIRP的过表达还可通过ERK/P38信号通路促进上皮向间质的转变，促进肿瘤的转移及浸润[50]。这些研究表明CIRP与肿瘤的发生、发展具有密切联系。2009 年，Zeng等[51]发现抑制敲除CIRP基因抑制CIRP蛋白表达，不仅能降低前列腺癌细胞(PC-3，LNCaP)的增殖能力，还能提高癌细胞对化疗药物的敏感性。此外有研究证实，降低CIRP的表达还能有效抑制TERA2、HeLa等细胞的生长。综上我们不难看出CIRP蛋白可能成为治疗癌症的新靶点。

4.6CIRP与免疫应答 在植物和哺乳动物中，模式识别受体(PRR)，其是识别病原体相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)的初始关键分子[52,53]。2007年，Fu等[54]首次发现植物冷诱导蛋白AtGRP7参与植物免疫应答。AtGRP7通过结合两种PRRs(FLS2和EFR)的转录子和蛋白质，显著增强PAMP引发的免疫反应[55]。而动植物的CIRP同源性高达99%，据此我们推测，哺乳动物冷诱导蛋白也参与先天免疫应答。2013年，CIRP被确定为在出血性休克和败血症期间从心脏和肝脏释放到循环系统中的新型炎症介质，且分泌的CIRP可作为DAMP，通过结合TLR4-MD2复合物(一类哺乳动物PRRs)，刺激TNF-α和HMGB1分泌进而引发炎症反应[56]。近期，Yang等[57]发现释放入血的CIRP增加细胞表面黏附分子表达，活化NAD(P)H氧化酶并激活Nlrp3炎症小体诱发血管内皮细胞凋亡。Klhan等[58]发现细胞外CIRP可通过TLR4信号通路接到内质网应激导致脓毒血症相关的急性肺损伤，Bolognese等[59]指出在脾脏，过表达的CIRP可直接激活CD4+和CD8+T细胞启动对脓毒血症启动适应性免疫反应。在腹主动脉瘤患者中血清及动脉瘤组织中，Li等[60]94发现了CIRP的表达，且过量表达的CIRP增加MMP-2、MMP-9、TNF-α和巨噬细胞的积累，而用CIRP中和性抗体下调CIRP的表达不仅抑制了巨噬细胞积累和MMP-2/9的过表达，而且抑制了动脉瘤的扩张。不仅如此，Ran等[61]和Chen等[62]等发现CIRP高表达于支气管上皮细胞，在冷应激下，通过ERK/NF-κB诱导炎症因子及气道黏蛋白的过表达而抑制其表达，可有效降低炎症因子和黏蛋白的表达。Yu等[63]研究发现在骨关节炎患者中CIRP呈高表达，且CIRP表达高低与疾病严重程度密切相关。总的来说，这些结果表明，在疾病状态下，CIRP可能释放到细胞外并通过扩大炎症反应而加剧组织损伤。

类似于上述CIRP在脑中的双重作用，最近的报告显示，肝脏中低温诱导的CIRP表达可通过降低ROS的生成来保护肝细胞[64]，而使用抗CIRP抗体中和血清中分泌的CIRP，能显著降低炎症反应并保护肝脏免于缺血-再灌注损伤[65]，另有研究也证实抑制CIRP表达可加速炎症反应速度，促进伤口愈合[66]。总得来说，细胞外CIRP通过诱导炎症反应引起细胞损伤。然而，在炎症的后期，损伤的细胞被炎症消除，功能障碍的细胞被再生细胞替代[67]，这意味着CIRP介导的免疫应答也可能具有有利的方面。这些结果提示CIRP在介导免疫应答过程中也具有双重功效。

5 总结

CIRP自从21年前首先被确定为冷应答蛋白以来，学者们为阐明CIRP的生理和病理生物学作用做了大量努力。目前，CIRP几乎分布于哺乳动物的所有细胞中，并且作为一种应激反应蛋白，通过过表达和核质穿梭转调节各种应激反应。细胞内CIRP作为RNA分子伴侣，通过与其靶标结合来调节mRNA稳定性，或通过与其他信号蛋白相互作用传递信号，从而调节细胞的增殖和分化、细胞生存与凋亡、肿瘤的发生发展及生物节律。另外，CIRP可以被分泌至细胞外，细胞外的CIRP作为促炎因子参与各种急性和/或慢性炎性疾病。考虑到在多种癌症中的广泛作用，CIRP被认为是一种新的癌基因，并且极有可能成为癌症治疗中的新治疗靶标。CIRP中和抗体在脓毒症和其他炎症性疾病中阻断CIRP诱导的炎症反应，强烈证明了CIRP在炎症相关疾病中的关键作用，并为CIRP中和抗体或CIRP靶向肽的治疗炎性疾病的潜力提供了理论基础。尽管我们在研究CIRP在细胞生物学和疾病状况中的作用方面取得了巨大成功，但仍有许多问题尚未解决，例如CIRP在慢性炎症性疾病如肥胖症、糖尿病和其他疾病中的作用如何。 因此，阐明CIRP在这些疾病中的作用将对(病理)疾病生理学的理解产生重大影响，并可能为设计新型治疗药物提供理论基础。