革兰阴性菌外膜囊泡的研究进展

冯文艳 张扣兴

(中山大学附属第三医院综合ICU，广州 510530)

所有活着的生物都释放外囊泡(extracellular vesicles, EV)到细胞外环境中[1-4]。革兰阴性菌产生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是自然不可复制的、高度免疫原性球形纳米粒子，有着重要的生物学功能[5-6]。革兰阴性菌分泌许多毒力因子以操控宿主细胞[7]，且通过一些机制使它们能在不同的环境定植和生存，例如I-VI型分泌系统已经被广泛的研究和发表。如今一些学者提出了细胞外的结构，例如OMVs—一种额外的独立的分泌方式，暂称为O型分泌系统。它们起源自外膜，因此组成成分与细胞膜成分相似。这些源自外膜的囊泡可以运输多种重要的生物分子：酶、毒素、抗原决定簇、脂多糖(LPS)和核酸[8]。因此，其所运输多种不同的物质分子，决定了它在细胞间的交流扮演着十分重要的角色。

1 OMVs的合成与成分

革兰阴性菌产生的OMVs是直径为10～300nm的球形双分子层脂蛋白，包裹的蛋白质、脂类、核酸、以及代谢物等物质，在细菌的致病机制、细胞间交流方面，发挥着至关重要的生物学功能[5,9-10]。OMVs起初被认为是细胞裂解的副产物，而后很快被证实OMVs是由革兰阴性菌外膜(outer membrane,OM)积极分泌产生的[5,11-12]。

1.1 OMVs的合成

OMVs是由细胞膜或是细胞器膜突起的一小部分脱落而产生。在真核细胞中这一过程已研究清楚，这是选择性的进程，精心的选择特定的细胞成分作为囊泡携带的货物以实现多种细胞功能。这一精细的过程是高度协调的系统，在囊泡形成之处，膜重组和改造，膜的曲率增大以便一个平面的膜成为一个球状囊泡[13]。由此我们推测，原核生物的这一进程与真核生物相似。膜的曲率的改变无论对于真核细胞还是原核细胞都是极度消耗能量的过程。由平面的膜形成球状囊泡所需的自由能(ΔG)大约是250～600kBT(kBT是热能单位)[11]。膜的曲率变化是由外膜蛋白之一“曲率诱导蛋白(curvature inducing protein)”实现的，包裹错误折叠蛋白(misfolded protein)及各种膜间质蛋白(periplasmic protein)。在OMVs内，内膜相关联的膜周质蛋白比同内膜紧密结合的蛋白质含量更高[14-15]。另外一种形成机制是，VacJ/Yrb ABC(ATP-结合型盒子)传输系统。在两种完全没有亲缘关系的革兰阴性菌流感嗜血菌和霍乱弧菌中实验，VacJ/Yrb的缺失或低表达使两种细菌的OMVs产物增加。脂质组学分析阐明了来源于VacJ/Yrb缺失突变型流感嗜血菌的OMVs富含某磷脂质和某些脂肪酸。结果显示OMVs起源的机制是基于外膜上突出小叶上的磷脂的积累。这一机制在革兰阴性菌中是高度保守的，这或许能够解释为何OMVs在所有生长环境下均能够形成，而且在体内可能有重要的病理生理意义[5,16-17]。

1.2 OMVs的成分

OMVs含有丰富的外膜蛋白(如OMPs、OmpA、OmpC和OmpF)，膜间质蛋白(如AcrA和碱性磷酸酶)，以及一系列与宿主组织黏附和侵袭有关的毒性因子。OMVs主要由细胞外膜的成分组成，例如外膜的磷脂质(phospholipids，PLs)、外膜的蛋白、脂多糖或脂质低聚糖，也含有其他成分如周质蛋白和细胞壁成分。同时，也含有内膜蛋白、细胞质的成分、DNA、RNA、离子、代谢物和信号分子等[1,18-19]。革兰阴性菌的细胞膜是脂质双分子层结构，两层膜夹着一个空间，夹着一层薄的肽聚糖。外膜是不对称的脂质膜。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和磷脂分别是外膜小叶和内膜小叶上最充足的脂质。LPS由脂质A、多糖核心和O抗原(一个长的多糖侧链)组成[20]。通过钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)的方法，用蛋白染色跟踪，研究对比纯化的外膜和OMVs的蛋白组成，发现二者的蛋白组成不同[21]。若OMVs是细胞裂解的随机产物，那它的蛋白组成应与细胞膜一致。然而，在OMVs中发现一些鞭毛蛋白或是分泌蛋白是细胞膜上所没有的[11]。因此，这些这种能量的消耗以及成分的多元化表明OMVs是一种主动的分泌过程。

2 OMVs的功能及致病机制

在各种不同环境下研究OMVs的分泌，发现周围环境情况的能量必须很充足，才允许OMVs的分泌[22-23]。因此，OMVs成分的选择性和细菌显著的能量消耗，提示OMVs对于革兰阴性菌必然发挥着至关重要的功能。

2.1 水平的基因转化及抗生素抵抗

在OMVs中发现的DNA能够成功的转化到其他菌细胞中，形成一种新的DNA传输系统[24-25]。先前的实验已经证明了OMVs释放到环境中可以传输各种物质(如酶、毒素等)到其他细菌中[26-28]；当OMVs与受体细胞表面接触并融合时，其包裹的物质被传输到受体细胞的细胞周质间隙。由此推测，这种融合也可以将其包裹在内的DNA传输到周质中，从而使DNA更容易进入细胞质，进而促进基因转化[25]。

更为重要的是，被包裹在OMVs中的耐药质粒，可以避免核酸酶的作用发生降解，从而导致抗生素抵抗基因水平传递到其他细菌，发生耐药传递。有活性的淋病奈瑟菌和流感嗜血菌及无活性的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌O157:H7的OMVs已被确认包裹着DNA。淋病奈瑟菌的OMVs包裹线性和染色DNA、质粒(其中一个携带青霉素抗性基因)以及少量的RNA。用这种OMVs与青霉素敏感的淋病奈瑟菌一同孵化，转化株能在抗生素环境中生存。这些数据表明OMVs介导的质粒转移能发生于淋病奈瑟菌之间[29]。大肠埃希菌O157:H7的质粒携带氨苄西林抗性基因(AmpR)和绿色荧光蛋白基因(pGFP)，将大肠埃希菌O157:H7的OMVs与缺乏这个质粒大肠埃希菌共同孵化，导致有荧光的转化株，这也表明，大肠埃希菌OMVs作为DNA运输的载体[30]。可见，OMVs有水平转移DNA的能力，是一种新发现的自然的转化载体，介导了细菌间耐药的传递过程。

2.2 生物膜的形成

生物膜是指附着于物体表面的微生物群，是一种环境适应机制，对细菌的生存有重要意义。细菌为了逃离不利环境，黏附于固体表面，以固着方式生长。生物膜内部的细菌能避免抗生素及宿主免疫的作用，从而引发持续性感染。OMVs能够刺激生物膜的形成。一株有生物膜形成能力的幽门螺杆菌菌株的OMVs能导致另一没有这一能力菌株的生物膜形成[31]。若能阻断OMVs的刺激作用，则有可能降低生物膜形成的几率，对临床的预后转归均有重大意义。

2.3 传输生物分子及细胞间交流

OMVs能贮存和传输多种多样的生物分子[32]，形成了一个保护机制以对抗宿主的蛋白酶和抗体。例如，在周质发现的溶血基因A(clyA)是非活性的，而在OMVs中发现的是活性的低聚合的溶血基因A[33]。OMVs可以增加包裹在其中的毒素的半衰期[26]，为各种毒素提供最佳的环境。

许多细菌通过细胞外信号来交流和协调，被称之为群体效应。疏水性群体效应分子涉及细胞与细胞间的交流，例如2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮是铜绿假单胞菌喹诺酮信号(Pseudomonas quinilonesignal, PQS)，参与了细胞间的信息传递，能在肺上皮细胞、支气管上皮细胞和巨噬细胞中诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，从而引发氧化应激，抑制肺上皮细胞的血红素氧合1表达，显著地诱导早期细胞凋亡，在铜绿假单胞菌感染宿主细胞时起着重要作用[34]。主动介导自身及铜绿假单胞菌产生的其他抗生素喹诺酮的包装。OMVs携带的PQS能够补足缺乏PQS的铜绿假单胞菌菌株。许多群体信号有明显的疏水性，有实验表明机会致病菌铜绿假单胞菌将信号分子PQS包装到OMVs中以在群体中传输。在细菌群体中除去OMVs则细胞间的交流终止，且抑制了PQS控制的群体行为[25,35]。

当革兰阴性菌感染宿主时，细菌与宿主的相互反应[11]。细胞间交流包括了种内及种间的细胞交流[26]。一些细菌能通过OMVs干扰宿主细胞的运输途径。例如铜绿假单胞菌通过OMVs包裹的毒素Cif细菌效应蛋白促进囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)的降解，CFRT是清除黏液纤毛所必需的。脂筏是细胞膜上一种有序的微区域，调节许多膜受体的活化，在OMVs与脂筏融合后，Cif细菌效应蛋白被释放入宿主细胞，OMVs阻止CFTR去泛素化，导致了CFTR的溶酶体降解。且效应蛋白能够帮助病原菌感染宿主并在宿主中定植[36]。Vanaja等[28]研究发现，LPS必须通过OMVs传输到细胞中。由此可见，提示OMVs能够携带和释放生物活性物质，并实现细胞间交流。

2.4 应激反应和免疫调节

研究发现细菌能够对周围环境做出反应，从而调整其OMVs的携带物质。当细菌在模仿含有沙门菌的液泡的环境下生长时，能在OMVs中检测到伤寒沙门菌的细胞膨胀致死毒素和LPS[37]。此外，OMVs中也曾发现参与抗生素降解的酶和免疫活性化合物[38]。在应激的环境中，细菌会释放一些不必要的或是不想要的物质，革兰阴性菌分泌出来的OMVs携带有毒成分、噬菌体和未折叠的蛋白质，以减轻包膜压力，保护自己得以避免环境情况的损害[26,32]。然而现在这一过程在大肠埃希菌中是通过哪一应激通路控制的仍然未知[39]。而在黏质沙雷菌，OMVs的产生是由温度调控的。在实验室环境下，黏质沙雷菌在22或30℃时产生大量的OMVs，而在37℃时产生的量很少。肠道菌的共同抗原(enterobacterial common antigen, ECA)综合体的失活导致大量囊泡的形成，这支持OMVs在应激状态下产生的观点。通过突变的ECA产生高产囊泡的表型能逆转Rcs-磷酸化反应调节器RcsB的失活，提示在这一种生物中OMVs的产生对于Rcs磷酸化的作用[40]。面对竞争性微生物，OMVs也有细菌内的作用，例如OMVs能被黏球菌利用以捕食其他细菌[41]。此外，在同一生态空间中发现竞争性微生物分泌抗菌素到OMVs内，选择性的杀灭其他种属的细胞[42]。细菌暴露于危险环境如抗生素、应激源、噬菌体、竞争性微生物或抗原位点已被宿主检测到时，OMVs的分泌会增加，这很有可能是一种新的防御机制[43-44]。

许多研究阐明不同来源的OMVs通过许多不同的方式激活宿主的免疫系统[45-47]，例如百日咳杆菌通过OMVs传输腺苷酸环化酶毒素到宿主细胞，导致细胞内的cAMP水平的提高[48]。OMVs传输的物质不仅仅只有蛋白质。一些物种例如伯氏疏螺旋体分泌OMVs以传输脂质来调节免疫应答[49]。

2.5 肠道的微生物稳态

OMVs能调节微生物群内稳态[11,50-51]。许多类型的拟杆菌对肠道健康的有重要意义。由脆弱拟杆菌合成的多糖A(polysaccharide A, PSA)通过调节性T细胞激活宿主IL-10的分泌，这对于宿主细胞对细菌的免疫耐受的形成是很重要的[52]。脆弱拟杆菌的OMVs还能传输PSA到树突细胞[53]。OMVs携带的PSA相较于单纯的PSA能够引发一串不同的免疫应答。这表明了OMVs的重要性，是肠道的微生物调节器的传输工具[54]。Elhenawy等[50]用蛋白质组学方法解释脆弱拟杆菌和多形拟杆菌的OMVs选择性包装大量的碳水化合物水解和蛋白水解酶。Rakoff-Nahoum等[51]的工作表明这些OMVs包装的水解酶对肠道的生态环境至关重要。许多拟杆菌属通过包裹在OMVs中的水解酶都能够消化吸收各种多糖。一种菌分泌的OMVs消化多糖的产物能够支持其他无法分解多糖的菌种的生长，形成肠道的内稳态。这说明基于OMVs的网络代表了在肠道菌群生态组织单位基本关系的创建，促进人类肠道的营养吸收。酶被包裹在OMVs中是能免于介质中蛋白酶的消化，说明了OMVs对肠道微生物环境稳态有重要作用。

2.6 OMVs的关键致病因子

OMVs能够传递DNA片段、自溶酶、细胞毒素、毒力因子和多种其他生物分子[55-57]，有助于细菌建立内部的交流，并加强与宿主的相互作用。在各种生理和病理功能有突出作用，如获取营养、诱发应激反应；传递毒素、黏连因子和毒力因子；逃避宿主防御系统。

以往认为在OMVs携带的各种物质中，蛋白是革兰阴性细菌OMVs发挥功能的主要物质，因此，做了许多OMVs相关蛋白的研究[33,58-59]。然而近期发现，能在宿主细胞中引起免疫应答的关键致病因子是LPS。LPS是OMVs中最富足的成分之一，分布在外表面。此前研究发现LPS进入胞浆中能够激活caspase-11炎症小体，进而引起炎症反应。然而，很多细菌本身并没有入侵细胞的能力。Vanaja等[28]为了证实OMVs介导的细胞死亡和IL-1应答都是由LPS而不是其他成分导致的，用野生型大肠埃希菌和突变型大肠埃希菌(缺少功能性己酰脂质A，因此缺少Caspase-11活化功能)刺激骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derive macrophage，BMDMs)，结果显示后者不能导致强烈的细胞死亡和IL-1α、IL-1β的分泌。为了了解LPS是否是OMVs功能性部分，Vanaja等[28]对OMVs用多黏菌素B做预处理，多黏菌素B是一种可以与LPS对抗的抗生素。然后测试它在炎症因子活化上的效应。用多黏菌素B做预处理的OMVs降低了诱发细胞凋亡和IL-1应答的能力。此外，来自革兰阳性菌的膜泡，如单核细胞增多性李斯特菌，缺少LPS，不能导致细胞死亡或是IL-1α和IL-1β的分泌。这表明，LPS是OMVs致病的关键组分，且OMVs是传输LPS到宿主细胞引发免疫应答的关键。

3 OMVs的提取及纯化方法

提取OMVs，要除去非囊泡的物质，如鞭毛、菌毛、纤毛和蛋白聚合物等，OMVs的纯度对后续相关研究有重要意义。囊泡可以从体外细菌培养或感染细菌患者的体液中分离出来。目前，一系列的实验指南对OMVs的分离提纯提供详细的操作过程。连续的离心，过滤，密度梯度超速离心法及替代的隔离方法，如凝胶过滤等[55-57]。提取后可通过透射电镜检测OMVs样本的纯度。

3.1 超滤法与超速离心相结合

体液或体外细菌培养后行差速离心，上层清液通过孔径为0.22～0.45μm的滤器和超速离心以提取OMVs[64-68]。细菌上层清液通过与给定的分子量滤膜，通常为50～100kDa，能够去除大部分与OMVs不相关的蛋白质。超滤膜材料的选择对于浓缩OMVs是至关重要的。膜的实际性能各不相同。有两种方式：一种是通过惰性气体施压，另一种是超滤离心。前者缺点是，由于过滤的力与膜垂直，导致滤膜容易阻塞，浓缩极化效应会减慢整个浓缩进程，部分OMVs附着于滤膜之上，增加不必要的流失。而后者通过选择设备，薄膜的方向几乎与离心力平行，可以规避极化效应[71]。再进行超速离心以浓缩OMVs。这种方法操作麻烦且耗时较长，但得到的OMVs的纯度较高。

3.2 单纯超速离心法(ultracentrifugation)

单纯超速离心操作简单，耗时少，然而超速离心并不能完全分离蛋白质聚合物和膜碎片[64]。只适用于后续实验对OMVs纯度要求不高的实验。

3.3 密度梯度离心法(density gradient centrifugation)

OMVs的脂质含量高，所以密度低于可溶性分泌蛋白、鞭毛和菌毛等，因此在密度梯度离心时OMVs迁移到较轻的层面[18]。最常用的密度梯度介质是碘克沙醇(optiPrepTM)[70]。其他密度梯度介质如蔗糖[71]和右旋糖酐[72]较少用于的OMVs的提取。粗提的OMV样本高密度溶液混合，再梯度覆盖低密度溶液[73]。在离心时OMVs根据浮力密度迁移到达平衡位置。离心后，从顶部或底部收集(通过刺穿管)OMVs用以后续研究。蔗糖梯度密度超速离心能够沉淀OMVs，但仍不能移除非囊泡物质[74]。密度梯度超速离心法是目前是提取OMVs的最好方法之一[64,69]。

4 OMVs作为疫苗的应用前景

疫苗通常要求辅助剂以增加疗效。传统的辅助剂，例如明矾，以一种无法控制的方式激活免疫应答。新型的辅助剂有助于以更协调的方式指挥免疫应答。基于OMVs的疫苗现在作为一种重要的生物技术。OMVs之所以能成为传统疫苗的替代有以下几个原因：首先，OMVs容易被提纯；其次，OMVs是天然脂质体，它的脂质组成和大小，具有增加免疫应答的辅助属性，同时减少所需的抗原量[75]；最后，它们能够被设计，允许外源抗原的存在[76]。

许多关于OMVs的疫苗研究说明OMVs是有前景的对抗细菌感染疫苗候选者，例如流感嗜血菌、多杀巴斯德菌、霍乱弧菌、产肠毒素的大肠埃希菌、脑膜炎奈瑟菌、百日咳博代杆菌和鼠伤寒沙门菌[77-81]。Shim等[4]研究发现无毒性的OMVs在小鼠和雪貂上能有效的增加流感疫苗的功效。无毒的fmOMVs是个有前景的佐剂能引起强健的T细胞预激，且能被广泛适用于对抗流感病毒感染的预防措施的发展。

动物实验证明，在小鼠身上，来源于革兰阴性菌的OMVs已经成功地用作疫苗以抵御细菌性脑膜炎和败血症，而且囊泡的组成能够被设计[82-85]。OMVs能够通过设计囊泡的外源抗原用作疫苗的平台。添加外源抗原到OMVs的主要优势是使抗原保持它们的天然构象，有触发特异免疫应答的能力，而且一个单独的产物能用于许多的疫苗[86]。

设计OMVs作为免疫调节系统，重新编程细菌用以疫苗的传送。现有更多研究以减少毒性但又不至于灭毒，在保证安全的情况下尽可能的保留其免疫原性。此外大规模的生产一致的自发型OMVs仍是需要关注的领域。迄今为止，大部分设计的OMVs都是单价的，即只能对抗单一病原体的；多价OMVs疫苗尚未纳入研究，但它可能提高现有的OMVs疫苗的效力[6]。

此外，OMVs疫苗可以扩展到过敏的预防治疗，用于针对免疫细胞对各种过敏原的耐受。OMVs已经被证明能被多种免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞(dendritic cell, DCs)内化。例如，Jones等[87]能够设计脑膜炎双球菌菌株应变产生OMVs通过DC-SIGN针对DCs。最后，结合OMVs的治疗也可以实现。OMVs耦合纳米粒子例如可以利用OMVs作为辅助剂的影响以及抗原表位的显示以定位靶向细胞[6]。

5 OMVs研究展望

近10年来外膜囊泡的研究数量大幅上涨，但目前其生物起源、形成过程及功能尚没有全面清楚的研究发表。相比于真核生物的相应的外泌体(exosomes)，目前在原核生物的OMVs研究仍较少。然而，革兰阴性菌对人类社会的影响较大，尤其是慢性病多重耐药菌。未来，OMVs的研究可作为突破口，对我们全面认识革兰阴性菌和防控其感染均有重大意义。