小鼠滴鼻剂量与麻醉方法国内近年文献分析

鹿双双, 荣 蓉, 师晓萌, 刘晓宇, 卢选成

(中国疾病预防控制中心实验动物中心, 北京 102206)

滴鼻是动物实验中常用的一项操作。研究人员需依据动物品种、年龄、体质量及样本(如病毒载量或者细菌浓度)等因素选择既满足实验要求又方便操作的滴鼻剂量及麻醉方法。本文期望通过对万方数据库收录的2011～2017年涉及小鼠滴鼻操作的文献进行统计分析，了解目前我国动物实验涉及小鼠滴鼻的操作中滴鼻剂量的使用情况、进行滴鼻操作时是否使用麻醉以及具体麻醉剂使用的情况，并对可能存在的问题提出建议。

1 方法

在万方数据库中, 以“小鼠”和“滴鼻”为检索词, 检索2011～ 2017年正文中含有检索词的文献。按照论文中研究工作涉及小鼠的动物实验, 并对小鼠进行了滴鼻操作, 筛选明确叙述了滴鼻剂量的文献。按照滴鼻剂量的多少、进行滴鼻操作时是否麻醉小鼠以及使用何种麻醉剂等内容对选入的文献进行了整理、分析, 统计分析采用 Excel 2013软件。

2 检索结果

按照方法中描述的检索策略，检索出770篇文献，其中513篇文献明确描述了进行小鼠滴鼻操作的剂量，其余256篇文献仅提及了滴鼻的方法，未写明滴鼻剂量，占所有文献的33.4%(257/770)。

2.1 滴鼻剂量

513篇文献中均叙述了进行小鼠滴鼻操作时的剂量, 其中有4篇文献对滴鼻剂量的描述为25～35 μL,但无法确定具体剂量，其余509篇文献中，滴鼻剂量最小为 1 μL，最大为500 μL。将滴鼻剂量划分为 20 μL、30 μL、50 μL、100 μL、200 μL 共5个节点，对其进行统计分析，详见表1。

2.2 麻醉方法的使用

在513篇文献中，有2篇是在小鼠清醒状态下进行滴鼻操作; 有253篇未提及进行滴鼻时是否使用麻醉，占49.3%; 有10篇提到麻醉，但是对使用的麻醉剂名称未提及; 其余249篇对滴鼻过程中使用的麻醉剂有明确的叙述, 其中3篇使用了氯胺酮和赛拉嗪混合麻醉的方式，另246篇中使用比例最高的3种麻醉剂依次是乙醚、戊巴比妥钠和水合氯醛。文献未提及使用麻醉方法的可能存在两种情况, 一种是没有使用麻醉，另一种是使用了麻醉, 但是文章中未描述。文献中使用到的麻醉剂详见表2。

表 1 小鼠进行滴鼻操作时使用剂量统计Table 1 The statistical analysis on dosages of intranasal administration in mouse

表 2 小鼠滴鼻操作时使用麻醉剂统计Table 2 The statistical analysis of anesthesia used in intranasal administration

3 讨论

通过对2011 ～ 2017年万方数据库中收录的涉及小鼠滴鼻操作的文献进行整理与统计分析，大致了解了目前国内进行小鼠滴鼻操作的滴鼻剂量使用情况, 了解了滴鼻操作时是否进行麻醉、以及麻醉时麻醉剂的使用情况。与此同时也发现了其中存在的一些问题, 包括在撰写论文中的一些不规范情况。

有文献[1]提到小鼠的滴鼻剂量应小于20 μL, 并认为滴鼻剂量过多或者滴鼻过快，动物会窒息乃至死亡。 Sonvico等[2]指出使用纳米颗粒作为混悬液进行滴鼻给药，最大剂量不宜超过100 μL。而国内研究报告中准确叙述了小鼠滴鼻剂量的文章中有53.3%(272/509)的文章滴鼻剂量集中在 30～50 μL。在实际工作中，作者体会到如果滴鼻剂量过多，样本会从鼻流入口腔或者以气泡的形式喷出。根据作者的操作经验，建议小鼠的滴鼻剂量应尽量控制在50 μL以内(单侧鼻孔不超过25 μL)，如果滴鼻剂量大于50 μL，可以连续几日进行滴鼻。滴鼻剂量还和动物体质量大小以及样本的类型以及纯度(浓度)等密切相关。

滴鼻给药是一种治疗方法，药物可绕过血脑屏障，经嗅觉神经和三叉神经直接作用于中枢神经系统，这样既可以减少药物的副作用又减少药物的使用量[2,3]。胰岛素在糖尿病小鼠模型[4-6]和去铁胺在阿尔茨海默氏症小鼠模型[7,8]的研究中, 已证明小鼠鼻内给药有治疗效果。这种情况下, 小鼠可以在清醒状态下给药, 但是小鼠须经过2～4周的驯化, 且单次给药剂量在20～30 μL[3]。文献[1]提到在进行滴鼻操作时, 小鼠应轻度麻醉, 将样本缓慢滴入鼻孔。如果没有足够的时间对小鼠进行驯化，作者建议在进行小鼠滴鼻操作时，应对动物进行适当麻醉。

对小鼠滴鼻操作中进行麻醉的249篇文章分析,使用比例最高的3种麻醉剂依次是乙醚(51%)、巴比妥类(24%)和水合氯醛(12%)。乙醚曾经是动物实验中广泛使用的麻醉药物，乙醚对呼吸系统有刺激性，可增加呼吸道分泌物; 如果麻醉过深，可抑制呼吸中枢导致动物死亡[9]。尤其在负压生物安全实验室中，由于实验操作人员对乙醚敏感性不同，如果操作的实验动物数量过多，会导致实验人员的不适，并且乙醚具有易燃、易爆等特性，目前已不推荐使用[9,10]。巴比妥类药物中最常用的是戊巴比妥钠。戊巴比妥钠是一种镇静催眠药，大剂量使用可产生麻醉作用，对呼吸中枢抑制作用较强，安全范围较小，麻醉过量易导致动物死亡[9]。随着我国对毒麻药的管控越来越严格，戊巴比妥钠不易在市场上购买。国内生产厂家无药物级的戊巴比妥钠，动物实验时只能使用化学级的戊巴比妥钠。若使用药物级的戊巴比妥钠，只能从国外进口，但是又存在进口周期长以及关税、价格高等诸多问题。过去，采用水合氯醛对小鼠进行腹腔注射麻醉也是一种常用的麻醉方法，水合氯醛对心血管功能影响小[9]。目前认为水合氯醛适合于催眠而非麻醉，水合氯醛会导致显著的呼吸抑制，对实验动物具有致突变和致癌作用[9,11]。2009年麻醉学杂志(Anesthiology)就不再发表使用水合氯醛进行麻醉或施行安死术的文章[9]。目前，异氟烷是一种广泛使用的吸入性麻醉剂，无色透明，不易燃不易爆，麻醉诱导和恢复快，体内代谢少。采用异氟烷麻醉对脑、肝脏、肾脏无不良影响; 维持麻醉时动物的心率、血氧分压、血液pH等生理功能稳定; 深度麻醉时，引起呼吸抑制[9,12]。值得注意的是，兔和龟类会闭气并产生严重的并发症，应避免使用异氟烷等对兔和龟类进行气体诱导麻醉; 在诱导麻醉后, 异氟烷可迅速且显著抑制雪貂血液学参数[13]。七氟烷无色透明, 不易燃不易爆, 对呼吸系统刺激小,七氟烷麻醉时诱导期短, 麻醉维持期平稳，苏醒快，是一种理想的吸入麻醉剂。异氟烷和七氟烷等新型吸入性麻醉剂操作简单、安全, 可快速诱导麻醉, 苏醒快。因此, 作者建议在滴鼻和动物手术等操作过程中根据实验需要选择合适的麻醉剂, 在不影响实验的前提下, 尽量使用异氟烷等进行麻醉[12]。

如果将文章中使用的麻醉剂分为注射性麻醉剂和吸入性麻醉剂, 使用注射性麻醉剂和吸入性麻醉剂的比例分别为40.6%(101/249)和59.4%(148/249)。使用注射性麻醉剂具有价格便宜、操作技术简单、麻醉持续周期不长，操作不复杂等优点，但也有易麻醉过度、单次注射不易把握麻醉深度、麻醉药受管控、麻醉起效慢、麻醉恢复慢等缺点。采用吸入性麻醉剂具有麻醉起效快、麻醉恢复快、容易掌握麻醉深度、麻醉药在动物体内新陈代谢少等优点, 但也有吸入性麻醉机价格昂贵、操作人员需要经过培训才能进行操作、动物呼出的麻醉气体需要回收等缺点[14]。在国外的动物实验中, 常用的注射性麻醉剂为戊巴比妥钠、丙泊酚、氯胺酮和赛拉嗪复合麻醉、氯胺酮和右美托咪定复合麻醉、氯胺酮和赛拉嗪以及乙酰丙嗪复合麻醉; 常用的吸入性麻醉剂为异氟烷和七氟烷[14]。需要注意的是动物的存活实验一般不使用戊巴比妥钠进行麻醉[14]。鉴于动物的伦理福利日益受到关注，在进行滴鼻实验时建议不要使用戊巴比妥钠进行动物的麻醉。

英国3Rs中心(Nation Centre for the Replacement Refinement & Reduction of Animals in Research,N C 3 R s)发布了《动物研究: 体内实验报告(ARRIVE)》指南[15]。ARRIVE指南明确指出, 撰写论文对涉及动物实验的伦理声明、动物的基本信息(品种、品系、年龄、来源等)以及实验操作的顺序、步骤等都要详细论述。调查表明, 33.4%(257/770)的文章未提到小鼠的滴鼻剂量。提到小鼠滴鼻剂量的513文章中，有49.3%(253/513)的文章未提及进行滴鼻时是否使用麻醉。目前很多国际杂志(如PLoS One[16])在投稿指南中, 鼓励研究人员按照ARRIVE指南撰写论文, 确保动物实验数据得到充分利用[17,18]。从2016年开始, 《中国组织工程研究》杂志提出投稿的论文按照ARRIVE指南撰写[18,19]。作者认为国内的中文学术期刊也应对投稿的论文加以要求，以提高动物实验报告的水平。