罗伊氏乳杆菌对组胺引起黄颡鱼肝肠损伤修复效果评价

成艳波 李 薇 韩木兰 许国焕 谢黎炜 印遇龙 梁建庆

(1. 广东省微生物研究所广东省部共建华南应用微生物国家重点实验室, 广东省微生物应用新技术公共实验室, 广州 510070;2. 广东碧德生物科技有限公司, 广州 510663; 3. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 长沙 410125)

组胺作为常见的一种生物胺, 广泛存在于生物体内, 其作为一种重要的调控因子, 在机体生理功能调节中扮演着重要角色[1,2], 然而养殖动物摄入过高浓度的组胺往往会出现中毒症状[3]。已有研究报道, 组胺会引起水产动物生长性能下降[4,5], 组织器官出现炎症反应、病理损伤[6—9]及体色变异[7]等。课题组前期研究发现, 摄食含组胺饲料(1000 mg/kg)的黄颡鱼, 脑组织促肾上腺皮质激素和黑素皮质素受体基因表达量下降、表皮酪氨酸酶活力和黑色素含量降低, 最终导致体色白(体)化[10]; 同时伴随有胃、肝脏和肠道发生病理损伤, 如胃部肿胀,肝脏炎症细胞增多及肠道皱襞数量减少、长度变短等[11]。然而, 中等浓度组胺对黄颡鱼生长性能及组织健康是否有影响, 尚不清楚。罗伊氏乳杆菌是已报道的几乎存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳杆菌, 对养殖动物生长、免疫和肠道屏障功能有显著的改善作用[12,13]。Ganesh等[14]报道, 罗伊氏乳杆菌可通过抑制甘油二酯激酶的磷酸化, 减轻组胺和组胺受体1结合介导的肠道炎症反应, 被誉为“微生物抗组胺药”。因此, 实验模拟水产饲料中使用较多的中等鱼粉的组胺含量, 研究中等浓度组胺对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)生长及组织健康的影响, 同时对罗伊氏乳杆菌对饲料中组胺的脱毒效果进行评价。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

实验以白鱼粉(组胺含量147 mg/kg)和豆粕为主要蛋白源, 设计3组等氮饲料, 分别记为C、H和H+B。其中C为基础饲料, H组饲料在基础饲料配方中添加了400 mg/kg的外源组胺, 以模拟中等鱼粉中组胺含量(GB/T 19164-2003); H+B组在基础饲料配方中添加外源组胺的同时添加了罗伊氏乳杆菌,乳杆菌以菌悬液的形式添加(实测活菌数为108CFU/g), 添加量为20%, 即在1 kg混匀的饲料原料中添加200 g菌悬液。实验用饲料原料经粉碎、过筛(40目)后, 制成直径为3 mm的颗粒饲料(制粒机, 型号KL120, 中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所)。空调房中风干(23℃)后, -20℃储存备用。在养殖实验结束时, 饲料中乳杆菌实测活菌数(成分分析保证值)为105CFU/g。详细的饲料配方及其营养组成见表 1。实验用罗伊氏乳杆菌菌株由广东碧德生物科技有限公司提供。

1.2 实验鱼

实验用黄颡鱼购买自广州鱼丰水产养殖发展有限公司。幼鱼入缸前用3% 的食盐水(浸泡15min)进行体表消毒。暂养2周后, 禁食1d, 用MS-222(80 mg/L)轻微麻醉后, 选取健康、体格均匀的幼鱼, 随机分配到9个圆形玻璃纤维养殖缸中(直径100 cm, 高75 cm; 缸内壁为银灰色), 每组饲料设置3个平行养殖缸, 放养密度为35尾/缸, 实验初始时鱼体重为(14.23±0.65) g。

表 1 饲料配方及成分分析Tab. 1 Feed formulation and chemical composition

1.3 养殖管理与饲料投喂

养殖实验在广东省微生物研究所室内养殖实验室进行, 采用静水、非循环养殖系统, 养殖用水为曝气后的自来水, 缸中有效水体约为缸体积的3/4。每隔3天进行1次换水, 换水量为养殖缸体积的1/3。整个实验周期水温的变化范围为23—30℃,水体pH变化范围为6.8—7.6, 溶氧＞ 6.0 mg/L。实验采用人工光照(12h光照, 12h黑暗)。每组饲料投喂3个平行缸的实验鱼。实验持续8周, 每天投喂2次(09:00和15:30), 日投喂量为每缸鱼总重的3%。每次投喂前5min停水、停气, 人工少量多次投喂, 以确保投到缸中饲料被完全摄食。投喂结束2h后用虹吸法对缸底进行吸污。每2周进行1次鱼体称重,调整日投喂量。称重前1d禁食。

1.4 样品采集与分析

养殖实验正式开始时取3×6条与实验鱼规格接近鱼样, 过量麻醉致死后, -20℃密封保存, 用作初始鱼体营养组成分析。实验结束时, 禁食1d, 用MS-222对实验鱼进行轻微麻醉, 每缸鱼批量称重后, 取5尾鱼测量体长和称重, 尾静脉抽血。采集的血液置于盛有冰块的泡沫盒中, 待完全凝固后,4000×g离心10min(4℃)。制备得到的血清样品于液氮中暂存, -80℃保存至分析。抽血后鱼样于冰盘上解剖后, 称量其肝脏、空腔重量。另取5条鱼去除胃中内容物后用作鱼体营养组成分析。

鱼体营养组成分析方法同饲料营养组成分析,按照GB/T-5009系列方法进行测定。鱼粉及饲料中组胺含量采用分光光度法测定(GB/T 5009.45-2003/4.4)。血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝脏谷胱甘肽S转移酶(GSH-ST)活力及肝脏丙二醛(MDA)含量等生化指标, 购买南京建成生物工程研究所试剂盒, 使用Thermo全波长酶标仪测定。采集的肝脏、肠道(肠道分段参见宋霖[15])及胃组织样品, 置于波恩氏液中, 4℃固定12—24h。样品经酒精梯度脱水及石蜡包埋后切片, 切片厚度为4 μm。切片经二甲苯脱蜡、苏木精-伊红染色及中性树胶封片后, 光学显微镜下(型号: OLYMPS CX31) 观察, 采集图像。

1.5 数据计算与统计分析

实验结束时鱼体增重(Weight gain,WG)、特定生长率(Specific growth rate,SGR)、饲料系数(Feed conversion ratio,FCR)、肝体比(Hepotasomatic index,HSI)、肥满度(Condition Factor,CF)和蛋白质效率(Protein efficiency ratio,PER)的计算公式分别为:

WG(%)=100×(FBW-IBW)/IBW

SGR(%/d)=100×[ln(FBW)-ln(IBW)]/t

FCR=FI/(FBW-IBW)

HSI(%)=100×WL/FBW

CF(100 g/cm3)=100×FBW/L3

PER(%)=100×(FBW-IBW)/(FI×FCP)

其中,FBW为实验结束时每尾鱼的平均重量(g);IBW为实验初始时每尾鱼的平均重量(g);FI为实验期间每尾鱼的摄食量(g);t为实验天数;L为实验鱼的体长(cm);WL为对应实验鱼肝脏重量(g),FCP为饲料中蛋白质的百分含量(%)。

测得实验数据用平均值±标准差(Mean±SD,n=3)表示。使用Origin 8.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)后, 采用Tukey对不同处理组组间差异进行多重比较分析, 且在P＜0.05时认为差异显著。

2 结果

2.1 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼生长性能和形态指标的影响

表 2显示不同饲料处理组黄颡鱼幼鱼WG、SGR、FCR和PER无显著差异(P＞0.05), 各组增重率为157%—163%, 蛋白质效率为2.1%—2.4%。各实验组黄颡鱼的HSI和CF差异不显著(P＞0.05)。

2.2 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼体组成的影响

各组实验鱼鱼体水分、粗蛋白、脂肪和灰分含量无显著差异(表 3)(P＞0.05)。在实验结束时, 鱼体粗蛋白含量为140—143 g/(kg湿重), 脂肪含量为85—89 g/(kg湿重)。

表 2 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼生长性能及形态指标的影响Tab. 2 Effects of histamine and L. reuteri on growth performance and morphology indexes of P. fulvidraco

表 3 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼鱼体营养组成的影响Tab. 3 The effect of histamine and L. reuteri on body composition of P. fulvidraco (g/kg)

2.3 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼肝脏健康状态的影响

组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)活力的影响见图 1。结果显示, H组血清ALT活力值为20 U/L, 显著高于C组血清ALT活力(5 U/L)(P＜0.05)。H+B组ALT活力(7 U/L)与C组无显著差异(P＞0.05), 但显著低于H组(P＜0.05)。各饲料处理组黄颡鱼血清AST与ALT变化趋势相同, 即H组血清AST活力(756 U/L)显著高于C组(241 U/L)(P＜0.05), H+B组AST活力(253 U/L)与C组无显著差异(P＞0.05), 但显著低于H组(P＜0.05)。

组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼肝脏谷胱甘肽S转移酶(GSH-ST)活力及丙二醛(MDA)含量的影响见图 2。结果显示, H组肝脏GSH-ST活力值37.49 U/mg prot, 显著高于C组肝脏GSH-ST活力(23.70 U/mg prot)(P＜0.05)。H+B组GSH-ST活力(25.48 U/mg prot)与C组无显著差异(P＞0.05), 但显著低于H组(P＜0.05)。H组肝脏MDA含量(1.95 nmol/mg prot)显著高于C组(1.35 nmol/mg prot)(P＜0.05), H+B组MDA含量(1.45 nmol/mg prot)与C组无显著差异(P＞0.05), 但显著低于H组(P＜0.05)。

图 1 血清谷丙转氨酶及谷草转氨酶活力Fig. 1 The activity of plasma ALT and AST

图 2 肝脏谷胱甘肽S转移酶活力及丙二醛含量Fig. 2 The activity of liver GSH-ST and the content of liver MDA

图 3为HE染色后黄颡鱼肝脏组织的显微结构。结果显示, C组肝脏细胞轮廓清晰, 细胞核(细实线箭头)清晰可见; H组肝脏中有较多炎症细胞浸润(红色箭头)和少量肝细胞坏死(蓝色箭头); H+B组肝脏组织细胞结构完整, 无明显异状。

2.4 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼肠道健康的影响

图 4为HE染色后黄颡鱼肠道组织的显微结构。观察显示, C组中肠肠道皱襞排列紧密(图 4C-1),细胞组织结构正常, 上皮细胞排列整齐, 微绒毛层相对齐整, 杯状细胞大小相对均一(图 4C-2); H组中肠肠道皱襞数目较对照组显著减少, 皱襞长度明显变短(图 4H-1), 水肿严重, 但肠皱襞尚未形成脱落(图 4H-2, 黑色箭头); H+B组肠道皱襞数目及皱襞长度有明显恢复(图 4H+B-1), 且无明显水肿现象发生(图 4H+B-2)。

2.5 组胺及罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼胃健康的影响

图 3 肝脏组织的显微结构Fig. 3 Microstructure of liver

图 4 中肠组织显微结构Fig. 4 Microstructure of mid-intestine

图 5 胃组织显微结构Fig. 5 Microstructure of stomach

图 5为HE染色后黄颡鱼胃组织横切后的显微结构, 由浆膜、肌层、黏膜下层及黏膜层组成。不同于肠道, 胃黏膜皱襞顶端较为平缓, 且黏膜层中无杯状细胞分布。结果显示, H组和H+B组胃组织结构较C组, 皱襞形态、数量及长度无明显差异(图5C-1、H-1和H+B-1); 胃皱襞上皮细胞排列紧密, 胃腺腺泡轮廓清晰, 可见细胞核散布其中(图 5C-2、H-2和H+B-2), 无明显病理损伤。

3 讨论

3.1 中等浓度组胺对黄颡鱼生长性能及肝肠健康的影响

组胺作为生理毒性最强的一种生物胺, 是组氨酸在微生物作用下脱羧产生的一种毒素, 其含量高低是评价鱼粉新鲜度的指标之一, 也是鱼粉质量等级评定的重要参照标准[16]。目前业内研究工作者多采用在配方中添加腐败鱼粉或外源组胺2种方式,研究组胺对水产动物生长及健康状况的影响。然而, 腐败鱼粉组分复杂, 除组胺外, 还含有毒素和尸胺、酪胺等生物胺。以腐败鱼粉为蛋白源时, 鱼粉中毒素对养殖动物的影响[9]及其他物质对组胺的作用(如鱼粉中的组胺增强子)[17—20], 使得难以准确判断组胺对养殖动物的影响。因此, 本实验采用添加外源组胺的方式研究组胺对黄颡鱼的影响。实验以优质白鱼粉为主要蛋白源, 在配方中添加一定量的外源组胺, 模拟中等鱼粉的组胺含量, 研究发现:饲料中组胺含量接近500 mg/kg时, 对黄颡鱼的生长性能(WG、SGR、FCR和PER)无影响, 相似的结果在虹鳟[6](组胺添加量2000 mg/kg)中也有报道。然而, 组胺却引起了罗非鱼[4]、大西洋庸鲽[5]生长性能的下降。董小林[21]研究发现, 饲料中添加1000 mg/kg晶体组胺对长吻鮠的摄食(FI)和生长(SGR)有促进作用, 而更高含量的组胺(6000 mg/kg)则对生长性能无促进作用。组胺对不同养殖鱼类生长性能的影响存有差异, 一方面可能是不同养殖鱼类对组胺的耐受性和敏感性不同, 另一方面可能是养殖环境的差异或组胺添加量的不同使得组胺在机体中发挥的生理功能不同。在实验条件下, 组胺对黄颡鱼生长及饲料利用无影响, 是由于组胺含量较低未引起生长性能的变化还是组胺对黄颡鱼生长无调控效果仍需进一步研究探讨。

组胺是机体内普遍存在的一种炎症因子, 其对水产动物组织器官的健康有一定的影响。Fairgrieve等[6]用组胺含量为2000 mg/kg的饲料饲养虹鳟,发现组胺会导致虹鳟胃部肿胀和黏膜层变薄。Opstvedt等[9]研究发现, 饲料中高浓度组胺会引起大西洋鲑胃肠道皱襞长度降低, 黏膜出现损伤; 在本研究中, 组胺未引起黄颡鱼胃组织显微结构的显著变化, 但肠道皱襞数目明显减少, 长度显著变短, 相似的结论Li等[11]也有报道。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是与体内三大营养(蛋白质、脂质和糖类)物质及氨基酸代谢过程最紧密相关的两种酶。两种转氨酶主要存在于肝脏中, 其活力高低是鱼体内蛋白质合成和分解代谢强弱的重要体现。在正常的生理状况下, 肝脏中ALT和AST活力极低,只有在肝功能发生障碍或肝细胞受损时, ALT和AST才会被释放到血液中, 并表现出较高的活力,因此, 常常通过测定血液中ALT和AST的活力变化来检测鱼体肝脏的受损伤情况。实验中测的对照组和乳杆菌添加组黄颡鱼血清ALT活力分别为5和7 U/L, AST活力分别为241和253 U/L, 数值上和朱磊[22]、吴代武等[23,24]报道的黄颡鱼血清ALT和AST活力值接近, 低于Elmada等[25]报道的血清ALT、AST活力(分别为11和328 U/L), 出现这种差异可能与实验用饲料配方及养殖环境的不同相关。谷胱甘肽过氧化物(GSH-ST)是一种具有多种生理功能的二聚体蛋白, 可促使体内谷胱甘肽与有害物质相结合或以非酶结合方式将毒性物质排出体外, 以达到解毒的目的[26]。在本研究中, H组肝脏GSH-ST活力显著高于C组, 这一变化趋势与血清ALT和AST活力变化趋势吻合, 表明中等浓度组胺对黄颡鱼肝脏有一定的损伤。然而组胺引起肝脏损伤的机制仍需进一步研究。

3.2 罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼生长性能及肝肠健康的影响

罗伊氏乳杆菌是已报道的几乎存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳杆菌, 是具有益生功效的肠道益生菌[27]。已有研究报道, 其可显著改善陆生养殖动物的生长性能、免疫能力及肠道屏障功能。在饲料中添加0.75%的罗伊氏乳杆菌可使仔猪平均日增重率提高20.07%, 并显著降低肝脏白球比和干扰素γ含量, 提升机体免疫能力[12]。给1日龄仔猪灌服罗伊氏乳杆菌, 可有效促进仔猪肠绒毛发育, 提高空肠二糖酶活力, 增强仔猪肠上皮细胞紧密连接蛋白表达, 改善肠黏膜屏障功能[13]。然而,罗伊氏乳杆菌对养殖鱼类的影响, 目前仅在罗非鱼中有见报道。Standen[28]研究发现在饲料中添加罗伊氏乳杆菌对罗非鱼生长表现(WG和SGR)、饲料利用率(FCR和PER)和鱼体营养组成无显著影响,但对其免疫能力(红细胞平均容量)有显著调节作用。在本实验中, 罗伊氏乳杆菌对黄颡鱼的生长性能及鱼体营养组成无影响, 可能与饲料中罗伊氏乳杆菌活菌数(105CFU/g)相对较低、养殖周期相对较短及养殖对象存有差异等因素有关, 但实验条件下罗伊氏乳杆菌会显著改善肠道组织的健康状况,使肠道皱襞数目、长度恢复到正常水平及减少皱襞脱落。罗伊氏乳杆菌可以显著改善宿主肠道健康的原因可能为: (1)代谢产生抗菌肽、黏膜免疫球蛋白等, 提高肠道免疫力[29]; (2)促进上皮细胞紧密连接蛋白表达, 改善黏膜屏障功能[13]; (3)调节细胞因子, 减少机体炎症反应[30]; (4)和致病菌竞争营养物质、能量, 促进肠上皮细胞分泌MUC2和MUC3黏蛋白, 从而抑制致病微生物在肠黏膜上的黏附[31]。

在本实验中, H+B组黄颡鱼血清ALT、AST和肝脏GSH-ST活力及MDA含量显著降低, 表明罗伊氏乳杆菌的添加可以显著减轻肝脏炎症反应。肠道不只是鱼体的消化器官, 也是鱼体最重要的免疫器官, 其与肝脏的相互作用是预防系统性炎症和保护肝脏健康的重要途径。罗伊氏乳杆菌可以显著改善肝脏健康状态可能与其维持肠道形态完整及改善肠道屏蔽功能及免疫能力有关, 相似的结论Hsu等[32]也有报道。另外, MDA含量的高低可以反映机体内脂质过氧化的程度和细胞的损伤程度, 实验中H+B组黄颡鱼肝脏组织MDA含量显著低于H组, 表明乳杆菌的添加减轻了肝脏的氧化损伤, 而乳杆菌具有一定的抗氧化能力也早有报道[33,34]。罗伊氏乳杆菌是通过维持黄颡鱼肠道形态完整、功能健全, 抑或是通过其自身或代谢产物的抗氧化能力来维持黄颡鱼肝脏健康, 有待进一步研究。

4 小结

基于本实验结果, H组(500 mg/kg)黄颡鱼血清ALT、AST、肝脏GSH-ST活力及肝脏MDA含量显著上升, H+B组血清ALT、AST、肝脏GSH-ST活力及肝脏MDA含量显著低于H组, 而和C组无明显差异; 组织显微观察, 发现H组肝脏有较多炎症细胞浸润及出现肝细胞坏死, 而H+B组肝脏细胞无明显损伤; 肠道皱襞数目减少、长度变短, 有严重水肿,而罗伊氏乳杆菌添加组肠道皱襞数目及长度均可恢复到正常水平。这表明在实验条件下, 中等浓度组胺使黄颡鱼肝脏、肠道出现了明显病理损伤, 而罗伊氏乳杆菌对组胺引起的肝肠损伤有一定的保护作用。