电针预处理脑保护作用机制研究进展

宁文华，李礼,2,3，郭扬,2，张宝瑜，王洋，赵梦雄，王舒,2,4

1.天津中医药大学第一附属医院，天津市 300381；2.国家中医针灸临床医学研究中心，天津市 300381；3.天津市针灸学重点实验室，天津市 300381；4.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室，天津市300381

脑卒中是全球致死和致残的主要原因之一，其中缺血性脑卒中占85%[1]。重组组织纤维酶原激活物仍是目前唯一批准用于缺血性脑卒中治疗的药物，但因其时间窗窄(4.5 h)、严格的适应症，仅能使部分患者受益[2]。大脑存在自我保护机制，能够适应诸如缺血等不良事件[3]；短暂的亚致死性刺激可以激活内源性保护机制，诱导脑缺血耐受，抵抗或减轻随后发生的缺血损伤，即缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)[4]。

针灸“治未病”历史悠久，早在《金匮要略》、《备急千金要方》等典籍中已有将针灸应用于预防脑卒中的记载[5]，可激发人体正气，增强抗病能力，防止疾病发生发展[6]。电针是传统针灸与现代电刺激的结合，具有简便、稳定、安全等特点，在缺血性脑卒中的临床治疗中应用广泛[7]。2003 年，动物实验首次证实脑缺血前重复电针刺激百会穴可以减轻脑缺血后神经缺损程度，发挥脑保护效应[8]，提出电针预处理的概念。此后十余年里，国内外学者针对电针预处理的脑保护作用机制开展了广泛研究。本文综述电针预处理诱导脑保护的作用机制。

1 调节内源性大麻素系统(endocannabinoid system,eCBS)

eCBS 是由内源性大麻素受体CB1R、CB2R，配体AEA、2-AG，以及负责转运、合成、降解的蛋白质组成的脂质信号系统[9]，在调控神经元存活方面有重要作用[10]。CB1R能够激活缺血神经元中的特定信号通路，促进神经元存活；CB2R 的激活可以减轻急性脑卒中后炎症和白细胞浸润，改善脑损伤[11]。大麻素受体激动剂对脑缺血具有神经保护作用[12]。

电针预处理后，大鼠脑内CB1R、CB2R 分别于2 h、24 h内明显上调，参与缺血后快速或延迟脑保护作用[13]。电针预处理还可通过上调AEA、2-AG 表达，作用于CB1R，诱导脑缺血耐受[14]。激活CB1R 可诱导epsilon 蛋白激酶C (epsilon protein kinase C,εPKC)活化[15]，激活细胞外调节蛋白激酶1/2 (extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)信号通路[16]，促进糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)磷酸化[17]，调节信号转导与转录激活因子3 (signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)磷酸化[18]。电针预处理作用于CB2R及其下游过程的研究较为欠缺。

2 抑制兴奋毒性

脑缺血后，突触前神经元释放大量谷氨酸；谷氨酸在突触间隙堆积，与突触后谷氨酸受体结合，导致钙内流，引发下游级联反应，造成兴奋毒性[19]。胞外谷氨酸的摄取主要依赖兴奋性氨基酸转运体2 (excitatory amino acid transporter 2,EAAT2)，负责清除细胞外约90%谷氨酸[20]。抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)可通过突触前或突触后抑制作用，拮抗谷氨酸的兴奋毒性作用[21]。

脑缺血再灌注后，EAAT2 表达降低，胞外谷氨酸浓度升高。电针预处理一方面促进EAAT2 表达[22-23]，逆转N-mcy 下游调节基因2 (N-mcy downstream regulated gene 2,NDRG2)上调，抑制STAT3 磷酸化[24]，减轻脑缺血损伤；另一方面，电针预处理上调脑缺血再灌注大鼠纹状体GABA水平，降低胞外谷氨酸浓度，抑制兴奋毒性，减轻缺血再灌注损伤[25]。突触前神经元谷氨酸分泌过程、突触后神经元谷氨酸受体结合过程以及相关调控环节在电针预处理中发挥的作用有待研究。

3 抑制氧化应激

氧化应激是脑缺血后主要的神经元损伤病理过程[26]，主要与自由基产生过多或抗氧化防御能力受损有关。电针预处理可以影响抗氧化酶表达，抵抗氧化应激损伤。锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)是线粒体内重要的抗氧化酶，可通过清除线粒体活性氧，减轻氧化应激损伤。电针预处理通过CB1R 介导的STAT3 磷酸化，上调脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带Mn-SOD 表达，增强其抗氧化能力[27]。过氧化还原酶6 (peroxiredoxin 6,Prx6)属于抗氧化蛋白超家族，可清除自由基，增强脑缺血再灌注后的抗氧化活性，抑制细胞凋亡[28]。脑缺血再灌注后24 h，Prx6 表达升高，电针预处理能够进一步上调Prx6表达，加速自由基清除，发挥脑保护作用[29]。

4 抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)

内质网是细胞内蛋白质合成和钙储存的主要场所，参与维持细胞内稳态。缺血缺氧等病理变化后，大量折叠蛋白在内质网腔内积聚，干扰内质网稳态，导致ERS[30]。适当的ERS 可维持细胞稳态，发挥保护作用；而内质网持续或过度应激，释放大量毒性物质，导致细胞钙超载，加重脑缺血损伤[31]。在应激条件下，生长停滞和DNA 损伤基因153 (growth arrest and DNA damage-inducible gene 153,GADD153)表达上调，参与ERS相关细胞凋亡过程；而葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)上调可缓解内质网内未折叠蛋白负荷，恢复蛋白质正确构象，维持内环境稳定，对细胞起保护作用[32-33]。陈怀龙等[33]发现，电针预处理可促进全脑缺血再灌注大鼠海马区GRP78表达，降低GADD153表达，减轻ERS反应。

未折叠蛋白反应是ERS的常见类型，涉及蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、活化转录因子6 (activating transcription factor 6,ATF6)和肌醇激酶1 (inositol requiring enzymel 1,IRE1)介导的3条信号通路，参与维持内质网稳态[34]。肖飞等[35]发现，电针预处理能激活脑缺血再灌注大鼠IRE1-X 盒连接蛋白1 (X-box binding protein 1,XBP1)信号通路，缓解ERS，减轻脑缺血再灌注损伤。而电针预处理对于PERK、ATF6介导的信号通路的影响仍然未知。

5 抑制炎症反应

炎症反应是缺血性脑卒中的关键病理过程，是影响其预后的重要因素。脑缺血发生后，白细胞浸润，释放多种促炎因子，如白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等，激活Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)，诱导炎症级联反应，加重脑损伤[36]。作为脑内主要的免疫效应细胞，不同小胶质细胞表型在脑缺血中具有不同作用：脑缺血后，小胶质细胞激活，表现为M1 型，启动炎症级联反应，加重脑损伤；而M2 型小胶质细胞可分泌抗炎介质，抑制炎症反应。

电针预处理能够降低脑缺血再灌注损伤大鼠促炎因子IL-1β、IL-6表达[37-38]，调控促炎因子TNF-α与抗炎因子IL-10之间的动态平衡[39]，下调缺血半暗带TLR4、核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappaB,NF-κB)表达水平[40]，对抗炎性反应，发挥脑保护作用。NF-κB 抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB α,IκB-α)与NF-κB 结合并抑制其活性，牟传琳等[41]发现，电针预处理抑制海马区IκB-α/NF-κB/细胞间黏附分子1 (intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)信号通路，减轻脑缺血再灌注损伤。电针预处理还可激活烟碱型乙酰胆碱受体α7 亚单位(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR)[42]，抑制高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)释放[43]，诱导小胶质细胞活化，由M1 型转化为M2 型，抑制炎症反应，发挥脑保护作用[44]。

根据现有研究，电针预处理抑制炎症作用主要通过调控炎症因子和小胶质细胞实现。星形胶质细胞是神经炎症的关键调控者，同样参与脑缺血损伤病理过程，电针预处理抗炎效应是否与星形胶质细胞有关及其机制均有待进一步探究。

6 保护血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)

BBB是存在于血液与脑组织之间的屏障结构，由脑微血管内皮细胞、胶质细胞、周细胞、紧密连接及其他细胞外基质组成，参与调节中枢神经系统物质交换，维持内环境稳态[45]。紧密连接蛋白(tight junction protein,TJP)是BBB 的重要组成部分，包括Claudins、Occludin、ZO-1，参与维持BBB 完整性。层粘连蛋白(lamina,LN)是细胞外基质的主要成分，与BBB 通透性的改变有关[46]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、膜泡运输、活性氧等多种因素参与破坏BBB 结构及功能，影响脑缺血预后或出血转化[47]。

电针预处理可通过抑制MMP-9表达，减轻TJP降解[48]，降低还原型辅酶Ⅱ氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)减少活性氧生成，下调星形胶质细胞水通道蛋白4 (aquaporin 4,AQP4)、LN 表达，上调ZO-1、Claudin-5表达，维持BBB完整性[49-50]。对脑缺血再灌注大鼠的研究发现[51-53]，7 d 和15 d 电针预处理均可促进Claudin-5 表达，抑制MMP-9、AQP4 及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，降低脑含水量和BBB通透性，以电针预处理15 d更佳。

7 抑制细胞凋亡

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，受Bcl-2、p53等多种凋亡基因调控。其中，Bcl-2 家族是影响细胞凋亡的关键调节因子，包括以Bcl-2 为代表的抗凋亡蛋白和以Bax 为代表的促凋亡蛋白两大类。Bcl-2 与Bax 作用形成异源二聚体，抑制Bax活化，是Bcl-2抗凋亡的重要机制[54]，二者的比值决定凋亡是否发生。

电针预处理可上调脑缺血再灌注大鼠低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)表 达[55]，升高Bcl-2/Bax 比值，降低p53 表达[56]，抑制细胞凋亡，且其抗凋亡作用的发挥与激活Wnt/β-catenin 信号通路有关[57]。脑缺血再灌注损伤后动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)表达增加，线粒体超微结构受损，神经元凋亡增加；电针预处理抑制Drp1 活性，从而抑制神经元凋亡[58]。

8 调节自噬

自噬是一把双刃剑，一方面通过对细胞内成分的清除及再利用促进细胞存活，维持细胞内环境稳态；另一方面，持续过度自噬超过细胞适应能力，参与细胞死亡过程[59]。

自噬受诸多因素的影响，其在缺血和再灌注阶段作用机制并不相同，对神经细胞结局的影响也存在差异。Wu等[60-61]分别观察电针预处理对脑缺血期和再灌注期自噬的调控作用，在脑缺血期，电针预处理通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路，激活自噬；而在再灌注期，电针预处理减少自噬体数量，降低自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-I比值；给予自噬激动剂雷帕霉素可部分逆转电针预处理的脑保护作用，提示再灌注期电针预处理可能通过抑制自噬发挥脑保护作用。周文婷等[62]建立脑缺血再灌注小鼠模型同样发现，电针预处理能够激活海马区mTOR、磷酸化mTOR蛋白表达，抑制自噬，从而减轻脑缺血再灌注损伤。

目前的研究多以神经元自噬为中心，脑中星形胶质细胞、小胶质细胞等其他类型细胞的自噬流，以及线粒体自噬同样与缺血性脑卒中病理过程密切相关，未来可从这一方向继续开展研究，综合分析自噬与电针预处理脑保护的关系。

9 小结

针灸治疗具有整体性的特点，电针预处理效应的发挥并不局限于某单一靶点或病理过程。根据现有研究，电针预处理可作用于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等多靶点，调节eCBS、抑制兴奋毒性、抑制氧化应激、抑制内质网应激、抑制炎症反应、保护血脑屏障、抑制细胞凋亡、调节自噬多水平发挥脑保护作用。

充分的临床前研究是成功进行临床转化的前提。我们需要结合研究现状考量更多因素，以指导后续临床转化。①不同环节的关联性：目前的研究多关注缺血级联反应中的单一致病环节，但缺血性脑卒中病理机制复杂，单一神经保护策略未必可行，未来研究需着眼于各病理过程之间相互联系，各细胞之间相互影响，如ERS诱导自噬、神经血管单元等。②时间窗：目前研究多集中于电针预处理作用机制，其效应持续时间尚未明确，未来可关注电针预处理确切的保护时间窗，并分析其相应机制，优化电针穴位、参数和干预周期等，为临床转化提供参考。③研究模型与目标人群一致性：现有研究工作通常选用幼年鼠，与缺血性脑卒中多发生于中老年人的临床现实不符，是否会造成基础研究及临床转化的差异，也需要进一步探索。