microRNA调节肌肉萎缩作用机制的研究进展

马翔，唐成林，吴梦佳，安荟羽，万小凤，谯童茜

重庆医科大学中医药学院，重庆市400016

肌肉萎缩是指肌肉的体积和质量减小以及肌肉正常功能受损，其发生主要与肌肉蛋白质代谢异常、肌细胞异常凋亡以及肌肉、血管再生困难等有关[1-2]。

在人类日常生活中由于车祸、地震等意外因素，骨骼肌很容易受到损伤而发生萎缩。此外一些疾病如糖尿病、癌症等发展到后期的恶病质特点之一就是严重的肌肉萎缩。肌肉萎缩导致肌肉功能受损是上述等疾病死亡率增加的重要原因之一[3]。

目前，肌肉损伤萎缩的主要治疗手段有物理治疗、药物治疗等。但这些治疗手段存在着诸多问题和后遗症：修复后的肌肉功能低下，容易发生再次损伤等[4]。马淑梅等[5]也指出，临床尚无成熟有效的方法治疗肌肉萎缩。因此，探索出新的有效的肌肉萎缩治疗方法显得意义重大。

microRNA(miRNA)在肌肉损伤修复过程中作用的发现为治疗肌肉萎缩带来新思路。已显示人类基因组中有高达1700多种miRNA，其中有多种miRNA已被确定在肌肉发生、发育和肌肉萎缩损伤修复中起关键作用[6]。这为miRNA成为治疗肌肉萎缩的新靶点提供可能性和丰富性。

本文将对miRNA在调节肌肉萎缩过程中的可能作用机制进行综述，为后期临床治疗肌肉萎缩及相关实验研究提供参考。

1 miRNA简介

miRNA是一类由约22个核苷酸构成的短的非编码RNA。它首先在细胞核中通过RNA聚合酶Ⅱ转录成为数千碱基长的初级转录物，其被称为初级miRNA或pri-miRNA；核酸酶Drosha和核酸酶Dgcr8将pri-miRNA切割成约60～70个核苷酸组成的中间体，称为miRNA前体或pre-miRNA；pre-miRNA通过转运蛋白-5(exportin-5)从细胞核转移到细胞质中，在这里premiRNA会被核酸酶Dicer切割产生一个由20～22个核苷酸构成的miRNA双链；随后miRNA双链由RNA解旋酶断链，产生两种潜在功能性的单链miRNA，分别是成熟链miRNA和过客链miRNA；之后过客链miRNA降解，成熟链miRNA将被掺入一种称为RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)中；RISC中成熟的单链miRNA主要通过它的“种子”区域(miRNA 5'末端的2～8个核苷酸)与特定靶miRNA 3'UTR端部分互补序列结合，从而降解靶miRNA或阻碍其翻译，发挥生物活性[7-8]。

2 miRNA调节肌肉萎缩的作用机制

miRNA调节肌肉萎缩的作用机制主要涉及肌肉蛋白质代谢、肌肉再生、血管再生以及肌细胞凋亡。

2.1 调节异常肌肉蛋白质代谢

miRNA调节异常肌肉蛋白质代谢主要包括抑制肌肉蛋白质异常降解，促进肌肉蛋白质合成，调节氧化应激。

2.1.1 抑制肌肉蛋白质异常降解

肌肉蛋白质降解的异常激活是导致肌肉萎缩的关键因素，而泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)途径在蛋白质降解过程中起关键作用。UPS途径是指蛋白质先被泛素标记，然后被蛋白酶体识别并引发降解过程。E3连接酶(ubiquitin protein ligase,E3s)是该途径的关键酶，参与识别底物以及控制靶蛋白降解速率。萎缩素第一型基因(atrogin-1)和肌环指蛋白1(muscle ring finger-containing protein 1,MuRF1)是两种肌肉特异性E3s[9]。在肌肉萎缩期间，MuRF1和atrogin-1在肌肉中过度表达；抑制MuRF1和atrogin-1的表达已被证明能够抑制肌肉损失并减轻肌肉萎缩[10]。

miRNA参与MuRF1和atrogin-1表达的调控：miR-23a/27a能够抑制MuRF1和atrogin-1的翻译，使肌肉中miR-23a/27a过度表达可预防糖尿病引起的肌肉萎缩并减少肾脏纤维化病变[11]。Wang等[12]发现，抗阻力运动会促进慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)模型小鼠体内miR-23a/27a的表达，过表达的miR-23a/27a在降低MuRF1和atrogin-1的同时还降低Smad2/3蛋白磷酸化水平，减弱CKD引起的肌肉萎缩。叉头转录因子(fork-head protein,FoxO)可以控制MuRF1和atrogin-1的表达。Xu等[13]发现，FoxO1的缺失阻断MuRF1和atrogin-1诱导的肌肉蛋白质降解；miR-486可以通过下调磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)的上游磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)来减少FoxO1蛋白的翻译，从而抑制MuRF1和atrogin-1的表达。miR-182可抑制FoxO 3a蛋白表达，进而阻止FoxO 3靶基因atrogin-1的上调，阻止糖皮质激素诱导的大鼠肌肉萎缩[14]。肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)也是一种泛素连接酶，miR-351可以通过直接靶向TRAF6的3'UTR端而显著下调TRAF6的表达水平；MuRF1和atrogin-1是TRAF6下游信号分子，miR-351从而间接抑制MuRF1和atrogin-1的表达以延缓失神经肌萎缩[15]。外源性注射miR-29a后可降低单侧输尿管梗阻诱发的肌肉萎缩并抑制肌肉中MuRF1和atrogin-1的上调[16]。此外，Liu等[17]发现，miR-18a也参与萎缩肌肉UPS途径的调节，并提出miR-18a可能是治疗骨骼肌萎缩的潜在新靶点。

从以上研究结果发现，miRNA可以直接或间接调控MuRF1和atrogin-1的表达，通过调节UPS途径来抑制肌肉蛋白质异常降解，调节肌肉萎缩。

2.1.2 促进肌肉蛋白质合成

有证据显示，在人和啮齿类动物的废用性肌萎缩模型中，肌肉基底细胞蛋白质的合成速率立即下降[1]。而胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是肌细胞内促发蛋白质合成的主要通路[9]。

低频率电针刺激可有效改善CKD诱导的肌肉萎缩，可能机制是低频率电针通过调控miR-1/206的表达，上调IGF/PI3K/Akt/mTOR通路，促进肌肉蛋白质合成以及改善肌肉蛋白质代谢[18]。在脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy,SMA)中，通过抑制SMA小鼠模型脊髓中miR-183的表达来调节mTOR通路，可延长SMA小鼠的存活并改善其肌肉萎缩程度[19]。近来有研究表明，miRNA以多种方式参与mTOR调控，或直接作用于mTOR，或作用于其上游IGF/PI3K/Akt通路，最终影响mTOR功能。例如，miR-99a/100/497能抑制IGF通路正调节因子IGF-1R的活性，负向调节IGF/PI3K/Akt/mTOR通路；miR-221/222/21/26a/19能使IGF通路的负调节因子PTEN表达受到抑制，正向调节IGF/PI3K/Akt/mTOR通路；而miR-100/7/199a/101能直接作用于mTOR，导致mTOR通路的活化[20]。

作为肌肉蛋白质合成的主要通路，IGF/PI3K/Akt/mTOR通路受到多种miRNA正向和负向的精细调控，以保证肌肉蛋白质合成速率维持在正常范围内。当肌肉损伤萎缩时，miRNA的表达会发生变化，这种平衡也将会被打破。

2.1.3 调节氧化应激

在废用和其他病理条件下肌肉萎缩过程中，氧化应激都会增强。在肌肉萎缩开始阶段，由于氧化应激作用，导致线粒体功能减弱，使氧化磷酸化出现障碍，能量生成不足，肌肉蛋白质合成速率降低；溶酶体膜被破坏，释放各种水解酶，肌肉蛋白质加速降解，导致肌肉萎缩[21]。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在肌细胞内大量生成会消耗抗氧化物质、促进氧化应激发生发展并加速肌肉萎缩[9]。还原型辅酶Ⅱ(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是催化ROS生成的关键因子，Nox4是NADPH氧化酶的主要催化亚基，miR-31可下调Nox4的表达，进而减弱NADPH氧化酶的活性[22]；在过氧化氢处理成纤维细胞使其发生氧化应激的过程中，miR-9可抑制Nox4的表达从而抑制ROS生成[23]。线粒体作为肌肉能量代谢的主要场所，是ROS形成的主要部位，miR19/27、miR-128a、miR-375和miR-210等可靶向于产生ROS相关的线粒体蛋白，参与ROS生成的过程[24]。

作为细胞内最关键的抗氧化因子，核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)表达水平的改变可直接影响其下游诸多抗氧化蛋白的表达。研究显示，诸多miRNA如miR-34a、miR-100、miR-21和miR-126等可直接影响Nrf2的表达水平，进而影响细胞氧化应激水平[25]。值得一提的是，26S蛋白酶作为Nrf2降解途径中的关键蛋白酶，其活性可由miRNA调控。这提示miRNA对Nrf2的调控可能是通过26S蛋白酶来完成的。胞质接头蛋白Keap1和Bach1是Nrf2两个比较重要的转录抑制因子，miR-7和miR-200在靶向Keap1 mRNA后，可下调Keap1的表达，进而激活Nrf2信号通路；高表达的miR-155可抑制Bach1的表达，进而通过Nrf2信号通路诱导血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1,Hmox1)表达，以增强细胞抵抗氧化应激损伤的能力[26]。此外，有研究者还发现通过靶向miR-183来调控Hmox1的产生可能对衰老肌肉中的氧化应激反应起到调控作用[27]。

目前miRNA对肌肉萎缩过程中氧化应激反应的调控作用还并不清晰。miRNA是否真的可以调节肌肉萎缩发生的氧化应激反应？若能调节，其具体途径又是什么？这些问题需要更多的研究来阐明。

2.2 促进肌肉再生

除了异常的肌肉蛋白代谢外，肌肉的再生功能发生障碍也是肌肉萎缩的关键因素。肌卫星细胞是一群具有自我更新能力的肌前体细胞，当骨骼肌受到病理因素刺激时，肌卫星细胞就会被激活，经历增殖和分化，最终发育为成熟肌管，促进肌肉再生[28]。

miRNA对肌肉再生起着关键的调节作用。配对盒转录因子(paired box transcription factor 7,Pax7)和组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)对肌卫星细胞增殖和分化至关重要。miR-1和miR-206通过抑制Pax7和HDAC4的表达来促进肌卫星细胞分化以达到肌肉再生目的。血清反应因子(serum response factor,SRF)是触发肌卫星细胞增殖所需的关键因素，miR-133通过靶向SRF来增强肌卫星细胞增殖，促进肌肉再生[29]。

肌源性调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)包括MyoD、MyoG、Myf5和MRF4。其家族在肌卫星细胞增殖后的成肌分化中起着重要的调控作用[30]。Amirouche等[31]通过电转移让Duchenne肌营养不良小鼠(mdx)肌肉中的miR-206过表达，过表达miR-206促进MRF4和MyoD等的表达，此外还观察到miR-206在mdx小鼠中表达的增加可减少促炎细胞因子的产生和巨噬细胞的浸润。这说明miR-206可以充当多效调节剂，通过靶向多种关键miRNA来调节Duchenne肌营养不良引起的肌肉萎缩。

MyoD和MyoG作为肌分化因子在激活的肌卫星细胞中高表达。刘泽远等[32]发现，通过构建大鼠胫骨前肌损伤模型并向局部肌肉外源性注射miRNA-1、miRNA-206和miRNA-133的混合物，发现与注射siRNA组相比，注射肌特异性miRNAs混合物组1周后能够有效诱导MyoD、MyoG和Pax7的表达，促进肌卫星细胞增殖和分化形成新生肌纤维，有效遏制骨骼肌萎缩发生。

有实验表明，被动运动可以促进大鼠失神经萎缩骨骼肌中miRNA-1的表达，同时miRNA-1的高表达促进MyoD的表达，进而促进肌卫星细胞分化，延缓失神经肌萎缩[33]。与此相似，在对体外小鼠C2C12成肌细胞进行周期性机械牵拉后，诸多miRNA的表达发生变化并引起肌分化因子MyoD和MyoG的表达升高，最终引起成肌发生[34]。

上述实验也为力学刺激治疗肌肉萎缩提供一定理论依据。

除了MRFs家族外，miRNA还通过靶向其他miRNA来调节肌肉再生，延缓肌肉萎缩。肌肉生长抑制素(myostatin)是肌肉再生的负调控因子；在向糖尿病小鼠注射miR-27后，研究人员发现miR-27可以直接靶向myostatin，促进肌生成增加。这项实验结果表明，miR-27可能会成为治疗糖尿病诱导肌肉萎缩的有效治疗靶点[35]。此外，miR-487b通过靶向肌肉合成代谢调节因子1(muscle anabolic regulator 1,MAR1)来调节Wnt5a蛋白，促进肌肉再生[36]；miR-27b通过靶向肌原调节抑制蛋白促进猪肌卫星细胞的分化，促进肌肉再生[37]；miR-34c通过抑制转录因子Yin Yang1(YY1)起到促进肌卫星细胞分化的作用[38]。

miRNA在调节肌卫星细胞增殖和肌原细胞分化过程中扮演着重要角色，尤其是miRNA-1、miRNA-206和miRNA-133作为肌特异性miRNA，在骨骼肌发育再生中起着举足轻重的作用。

2.3 促进血管再生

正常骨骼肌每根纤维受3～5条毛细血管供应。在失坐骨神经后的肌萎缩过程中，肌纤维毛细血管逐渐减少至1条，肌纤维血供不足也是导致肌肉萎缩的机制之一[39]。血管生长因子是一类具有促进血管生长、发育、再生和创伤修复功能的生长因子。其中较为重要的有碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。

有实验研究显示，如miR-126/15a/16/125/146/101等许多miRNA参与对bFGF和VEGF的调控[40]。在Mellis等[41]的研究中，miR-26b首次被鉴定为促血管生成因子，发现miR-26b的过表达会促进血管内皮细胞中血管生成素2(Ang-2)和血小板衍生因子(platelet-derived growth factor,PDGF)的表达，通过刺激新血管形成以提高缺血肌肉组织的活力。并提出miR-26b是治疗严重肢体缺血疾病的优秀治疗靶点。

上调血管内皮细胞miRNA-24的表达可抑制转录因子GATA2和P21基因激活酶PAK4表达，促进受损内皮细胞形成毛细血管网。体内研究结果表明，通过局部抑制miRNA-503可以改善糖尿病引起的缺血性损伤，促进血管再生[42]。

最近Singh等[43]发现，Etv2/miR-130a/Jarid2通路在体外和体内血管生成中也具有重要作用。

血液提供氧份和营养，同时带走肌肉产生的代谢废物。当肌肉开始萎缩时，会逐渐失去血液供应。由于得不到血液的营养和代谢作用，肌肉进一步萎缩，产生恶性循环。利用miRNA促进血管生成的作用，重新建立萎缩肌肉血液供应系统，使肌肉重新获得营养以调节肌肉萎缩，这将是一个新的治疗思路。

2.4 抑制肌细胞异常凋亡

细胞凋亡是指细胞为适应环境正常的程序性死亡，但异常增强的肌细胞凋亡是肌肉萎缩的促进因素之一。动物实验显示，在失神经支配、失重等原因造成的肌萎缩小鼠中细胞凋亡水平异常升高[44]。

miR-23a/27a可通过降低半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和caspase-7的活化来抑制细胞凋亡[12]。miR-21是白细胞介素-11(interleukin-11,IL-11)下游细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2)和信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription-3,STAT3)信号传导的关键调节剂，并可起到抑制骨骼肌成肌细胞凋亡的作用[45]。

在急性肌肉损伤中，使miR-351过表达可保护成肌祖细胞(muscular progenitor cell,MPC)免于在其分化过程中凋亡，这在肌肉修复过程中具有重要意义[46]。在mdx小鼠中外源性注射miR-486，可通过DOCK3/PTEN/Akt通路来抑制萎缩肌肉的异常细胞凋亡[47]。

此外，miRNA还可以参与线粒体通路诱导的肌细胞凋亡过程。miR-214、miR-467a和miR-221能与凋亡因子Bax的3'UTR区结合进而抑制Bax的表达，对细胞凋亡有抑制作用。miR-181a也是细胞凋亡的拮抗剂，它通过增加线粒体对细胞凋亡的敏感性来拮抗细胞凋亡[48]。

近年发现，内质网应激的发生也会引起肌细胞凋亡。Xu等[49]研究发现，在小鼠成纤维细胞中，miR-216b可靶向氨基端激酶c-Jun来抑制内质网应激激活的信号通路(PERK通路和Ire1通路)，从而降低细胞对内质网应激的敏感性，抑制凋亡的发生。这些都说明miRNA很可能是调节萎缩肌肉异常细胞凋亡的关键介质之一。

3 小结与展望

miRNA作为一类非编码RNA，在基因表达的调控上有着广泛作用。目前miRNA在肌肉萎缩修复方面的研究多集中在肌肉蛋白质合成降解和成肌细胞增殖分化两个方面，其中miRNA主要通过mTOR通路和UPS途径来调节肌肉蛋白质合成降解。研究手段以过表达萎缩肌肉中miRNA的含量和基因活性检测确定萎缩肌肉中miRNA靶基因为主。

随着分子生物学的不断发展，越来越多的miRNA被证实在肌肉发育和损伤修复中具有重要作用。有望为治疗肌肉萎缩提供新靶点。

然而，通过何种方式或手段来靶向miRNA最为合适，还有待研究人员发掘。对肌肉萎缩病理状态下miRNA表达量变化的进一步研究，将对阐明miRNA调节肌肉萎缩的具体作用机制带来帮助。此外，miRNA数量庞大，且一种miRNA能够靶向多个靶基因，而同一靶基因又可被多种miRNA靶向，进一步发掘未知miRNA并探索其具体靶基因和功能将对肌肉萎缩的治疗具有重要意义。