降低农产品中黄曲霉毒素的技术

徐纬昊，刘艳明，刘建龙*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南 250014；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250000）

黄曲霉毒素主要是由寄生曲霉和黄曲霉产生的具有极强致癌效应的剧毒天然次生代谢产物[1]。黄曲霉素的毒性，远远高于氰化物、砷化物和有机农药，其中以B1毒性最大，在农作物、畜禽产品和饲料中含量较高。当人体一次性摄入量过大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当持续微量摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。黄曲霉素的致癌力居首位，是目前已知最强致癌物之一。因此，如何降低饲料原料中黄曲霉毒素含量的问题引起人们广泛关注。

1 黄曲霉毒素的特性及危害

1.1 特性

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉在特定的环境条件下发生了复杂的酶促反应后生物合成的剧毒次级生物代谢产物，在发生霉变的粮食作物及粮油制品中含量较高[2]。黄曲霉毒素B1易溶于有机溶剂，难溶于水，不溶于乙醚、石油醚等，根据其化学结构可以看出，其结构中含有大环共轭体系，因此其理化性质稳定，是迄今为止发现的最稳定的真菌毒素之一。黄曲霉毒素的熔点为268～269 ℃，所以在高温和紫外照射下黄曲霉毒素很难发生分解，在酸性及中性环境下也很稳定，只有在碱性环境中才能分解[3]。黄曲霉毒素在食品加工过程中难被破坏而造成残留，在气候温暖、降雨稀少、低纬度的区域下最为常见。

1.2 危害

黄曲霉毒素属毒性极强的致癌物质，现已发现了17种，主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2，其中黄曲霉毒素B1毒性最强，其毒性远高于有机农药、氰化物及砷化物。在1993年被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构列入一级人类致癌物[4]。黄曲霉毒素为二氢呋喃香豆素的化学结构类似物，因此同时具有强毒性和高致癌性，属食源性二级真菌毒素[5]。

1.2.1 对人类的危害

黄曲霉毒素一方面直接影响畜禽等的机体健康，同时会通过食物链的富集作用威胁人类健康[6]。黄曲霉毒素的毒性主要有急性毒性、慢性毒性和致癌性。急性中毒往往会发展为胆管增生、急性肝炎、肝细胞坏死，通常是误食了被黄曲霉污染的食品的原因，不仅如此，黄曲霉毒素还会使免疫系统受损，导致儿童发育受阻。少量多次的摄入黄曲霉毒素会引起肝癌，属于慢性毒性。黄曲霉毒素还具有致畸致癌作用，主要是因为黄曲霉毒素B1进入人体后使癌细胞中的发挥抑癌作用参与细胞调节的p53基因发生突变，导致其蛋白质空间结构发生变化，丧失其特定的生理功能，重则促进细胞癌变；黄曲霉毒素B1在人体内主要发生环氧化和去甲基化等代谢过程，会产生同样的具有致癌、致突变的剧毒代谢产物，在人体内积累到一定量后会造成生长受阻，同时会导致食物利用率下降、肝衰、肝损伤，逐渐发展为癌症。

1.2.2 对粮食作物的危害

黄曲霉毒素是一种常见的丝状真菌，主要污染粮食作物，玉米、小麦等常常受其侵害而发生霉变；还会污染动植物食品，如肉制品、奶制品、动物饲料等，而且，黄曲霉及黄曲霉毒素更喜欢侵袭脂肪含量丰富的油料作物，如花生、大豆等，其中，对花生和玉米的污染最为严重。玉米喜温，最适生长温度在30 ℃左右，黄曲霉菌的最适生长温度为28 ℃，由于最适生长温度相近使得玉米被黄曲霉污染的几率提高[7]；而且玉米胚部体积较大，大约占全粒体积的三分之一，且含有丰富的营养物质，代谢旺盛，为黄曲霉提供了适宜的生长环境，因此导致玉米极易被黄曲霉污染，尤其是玉米的籽粒，由于黄曲霉毒素在自然条件下难以被分解，因此黄曲霉及黄曲霉毒素的污染成为我国粮食生产的一大安全隐患，为了有效减少污染，选用高抗的优质品种成为当前研究的重点[8]。

1.2.3 对畜禽的危害

黄曲霉毒素对动物的危害主要体现在免疫功能、生长发育、繁殖能力等方面。黄曲霉毒素会对动物造成免疫抑制，主要作用于细胞免疫，而且能与DNA或RNA结合，同时抑制其合成，最终导致产生的抗体减少[9]。简单来说就是AFB1降低了血清中抗体和免疫球蛋白水平，削弱吞噬细胞能力，导致机体抵抗力下降，从而免疫失败。大量研究表明，黄曲霉毒素会破坏饲料中的营养成分，若饲料中含有大量毒素则会使动物采食量降低，毒素进入机体后能降低胰酶活性，影响激素和酶的合成，使吸收和代谢缓慢，造成动物食欲不振、消化不良、生长发育滞后等。黄曲霉毒素会导致畜禽的生殖器官发生病变，导致受精率下降、孵化率降低、胚胎死亡率增加、导致孕畜早产或流产等。因此，黄曲霉毒素会导致畜禽繁殖能力下降，直接影响经济效益[10]。

2 黄曲霉毒素的检测方法

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有三种，分别是薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法。

2.1 薄层层析法

薄层层析法是最传统的检测黄曲霉毒素的方法，主要是利用了黄曲霉毒素B1的溶解性，虽然此方法快速又便捷，但操作步骤多、样品预处理繁琐、误差偏大，现在基本不采用此法。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法主要是利用了不同物质在固相和液相中分配系数的不同达到分离的目的。此法适用于多种及大量样品的分析检测，而且用时短、灵敏度高，但是所用设备先进且昂贵，同时对操作技术的要求较高，因此限制了它的应用范围。

2.3 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法是迄今为止国际上认可的科学有效的检测黄曲霉毒素B1的方法，此法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，结合后的酶标记抗体可以跟吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体被氧化，出现颜色反应，由无色变为有色。因而可以通过底物的颜色变化来判定有无相对应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比，此种显色反应可通过仪器进行定量测定。

相较于前两种方法来说，酶联免疫吸附法检测成本更低、特异性更强、灵敏度和效率也相对高一些，是实验室主要的检测方法，同时也是国家标准的检测方法之一[11]。

3 黄曲霉毒素的脱毒方法

解决黄曲霉毒素问题的基本措施包括抑制黄曲霉毒素的产生及对已污染的作物进行去毒脱毒，尽量降低黄曲霉毒素的危害。防止黄曲霉毒素的污染，脱毒只是后续的补救措施，而最根本的是抑制其产生，从根本上解决问题，黄曲霉毒素的脱毒方法大致包括理化去除法和生物去除法两大类。其中理化去除法主要是利用物理和化学的方法来去除霉菌，比如筛选剔除、辐射降解、吸附、有机溶剂萃取等；生物去除法主要利用真菌细菌等微生物对黄曲霉毒素的吸附降解作用来达到脱毒的目的。

3.1 物理吸附法

物理吸附法被认为是最经典的脱毒方法，常用的吸附剂有活性炭、膨润土、水合硅铝酸盐、酵母细胞壁等，在工业生产中，一般采用硅酸盐吸附剂以及纳米吸附剂来去除霉菌毒素，吸附的主要原理是利用硅酸盐吸附剂多孔性与静电作用，与带有离子极性的毒素结合，从而达到去毒的目的。刘媛婷等[12]通过进行体内实验、体外实验和动物实验，比较了5种霉菌毒素吸附剂的吸附特性以及使用效果，其中水合硅铝酸盐与活性炭组合吸附剂在pH6.0时吸附率达91.71%，解吸附率为15.05%，比单独使用水合硅铝酸盐吸附剂高出8.06%，得出水合硅铝酸盐与活性炭的组合吸附剂对黄曲霉毒素的吸附效果最好。特别注意的是，有些吸附剂在吸附毒素的过程中也会吸附很多营养物质，并且有可能在动物体内代谢过程中解吸，重新暴露，对动物造成危害。因此物理吸附法应进一步优化并明确吸附剂的代谢过程，降低解吸附率，尽可能减少吸附剂对营养物质的吸附。

3.2 生物吸附法

在生物脱毒法中也有利用微生物吸附霉菌毒素的方法，如乳酸菌黏附法。乳酸菌自身具有黏附作用而且其分泌的代谢产物也具有抑菌作用，因此其主要通过分泌的有机酸和过氧化氢等来抑制霉菌生长，从而减少黄曲霉毒素的含量。另有一部分乳酸菌可以与黄曲霉毒素构成复合体，形成的复合体粘性降低，从而可以轻易地被排出体外，降低黄曲霉毒素的危害。GOURAMA等[13]的研究表明，市场上的青贮饲料在接种植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的混合菌种之后，表现出抗黄曲霉毒素的活性。最近在Oluwafemi等[14]的研究中发现一种从发酵玉米中提取的可以吸附黄曲霉毒素的嗜酸乳杆菌，但是当黄曲霉毒素浓度增加，吸附效果降低31%。Lahtinen等[15]的研究表明，鼠李糖杆菌细胞壁中的肽聚糖对AFB1有较强的结合能力，但具体是哪一组分起关键作用目前尚未明确。此种方法没有使用其他化学试剂，无污染且效率高。但是也有研究表明，由于此吸附作用可逆，而且毒素并没有消失，所以随着时间的慢慢推移，又会重新释放出部分毒素，所以生物吸附法并不是很理想的脱毒方法。

3.3 生物降解法

其他微生物去除黄曲霉毒素的途径主要是利用微生物及其所产生的酶来使毒素降解失活，失去其毒性作用，主要是真菌与细菌对黄曲霉毒素的降解作用。对黄曲霉毒素有降解作用的真菌主要有根霉、寄生曲霉、白腐真菌、黑曲霉等[16]。20世纪70年代末，Doyle等[17]发现了寄生曲霉代谢产生的过氧化物酶可以降解黄曲霉毒素B1，并且黄曲霉毒素降解率与过氧化物酶活性两者存在正相关关系。80年代，Huynh等[18]发现毛霉、黑曲霉等少数真菌都对黄曲霉毒素B1具有良好的降解作用。Maris等[19]从白腐真菌与褐腐真菌中提取并纯化了胞外解毒酶，胞外酶降解成为黄曲霉毒素脱毒技术研究上的热点方向之一。刘大岭等[20]采用基因工程技术使解毒酶在毕赤酵母成功表达，提高黄曲霉毒素解毒酶活性及稳定性。上述研究表明，真菌降解黄曲霉素是一个复杂的过程，环境条件以及其自身因素都会对其造成影响，并且过程的可控性及稳定性较差，降解产物不定向，但是研究发现，真菌中的单一活性成分对黄曲霉毒素有很好的降解效果。在国外的研究中，Lilleho等[21]在1966年发现橙色黄杆菌能够降解黄曲霉毒素B1，Doyle等[22]证明这一能够降解黄曲霉毒素的物质是乳过氧化物酶，Smiley等[23]进一步证明橙色黄杆菌降解黄曲霉毒素的机理是酶促反应。Cserhati等[24]发现红球菌能够很好地降解黄曲霉毒素。在国内的研究中，林峰等[25]的试验表明，微生物对霉菌生长有一定的抑制作用，他验证了有10株芽孢杆菌对寄生曲霉的菌丝体抑制率在80%以上，并且在试验过后综合筛选出7个对寄生曲霉菌丝体抑制效果良好的菌株。李俊霞等[26]发现假单胞菌属嗜麦芽窄食单胞菌对黄曲霉毒素有极好的降解作用，降解效率达到85.7%。关舒等[27]证明嗜麦芽窄食单胞菌是利用代谢产生的生物酶对黄曲霉毒素进行降解。雷元培等[28]通过试验研究发现枯草芽孢杆菌分泌产生的一种胞外酶能够很好地降解黄曲霉毒素，起到良好的解毒作用。同时分泌的活性蛋白具有强解毒活性、特异性而且作用效果温和，不会破坏或影响饲料中的营养物质，而且具强抗逆性，是去除饲料中黄曲霉毒素的一种良好途径。

关于生物脱毒法主要有在三个，最根本的是抑制霉菌的生长从而减少毒素的产生和积累，二是利用微生物的吸附作用进行脱毒，三是利用微生物或者其产生的胞外酶来降解黄曲霉毒素。生物脱毒法相较于其他方法来说更加温和有效，也更环保，因此也具有更加广阔的发展前景。

4 展望

随着生物技术的发展，利用蛋白质工程、发酵工程、酶工程、细胞工程等手段，结合微生物应用技术、分子生物技术等新型生物技术进行黄曲霉毒素的脱毒防治已成为研究重点。对于目前黄曲霉毒素的防治方法中，生物防治方法对饲料营养物质不造成损失，对环境无污染，而且具有特异性，能避免毒素的产生，因此成为当前相对有前途和有效的方法。然而目前国内外将生物脱毒技术应用到饲料工业中才刚刚起步，利用生物酶降解黄曲霉毒素的关键在于培育出能产出高活性解毒酶的菌株，并且在实际应用中创造出一个有利于酶促反应的环境。因此通过各种生物技术来获得更优质和适用范围更广的解毒酶是今后研究的方向。

减少黄曲霉毒素的根本就是抑制黄曲霉和黄曲霉毒素的产生，因此可以利用基因工程直接改变黄曲霉的基因序列，从而抑制黄曲霉产毒基因的表达，改变蛋白质的空间结构，最终使黄曲霉代谢产物失去毒性，从根本上解决黄曲霉毒素的危害问题。