谷物及其制品中真菌毒素的前处理及检测技术研究进展

侯广月，杜营，杨帆，周莉莉，许士明，邹惠玲

（山东省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心＜山东＞，山东济南 250102）

真菌毒素是产毒真菌在适宜条件下产生的小分子有毒次级代谢物，目前已发现300多种[1]。据报道，全球每年约有25%的农产品被真菌毒素污染，造成数百亿美元的损失[2]。真菌毒素污染不仅发生在农作物种植期间，在其收获、贮存、运输等环节也会发生[3]。被污染的谷物及其制品通过食物链传递，对人、畜的肝脏、肾脏、造血系统、生殖系统及神经系统等造成损害，部分真菌毒素还存在致癌、致畸、致细胞突变的重大危害[4]。因此，真菌毒素被世界卫生组织（WHO）和联合国粮食与农业组织（FAO）列为食源性疾病的三大根源之一[5-6]。真菌毒素的强毒性和高污染频率，已经成为国际社会重点关注研究的食品安全问题之一。现行国家标准GB 2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》对谷物及其制品中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的最大允许含量水平进行了规定[7]。

目前，谷物及其制品中真菌毒素的分析主要包括样品前处理和仪器检测两个环节。样品前处理常用的方法有液液萃取技术（Liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取技术（Solid phase extraction，SPE）、QuEChERS技术、凝胶渗透色谱技术（Gel permeation chromatography，GPC）、免疫亲和层析技术（Immunoaffinity chromatography，IAC）和免疫磁珠技术（Immunomagnetic microbeads，IMBs）。仪器检测方法主要包括薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、气相色谱-串联质谱法（Gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、液相色谱法（Liquid chromatography，LC）和液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）。本文对真菌毒素残留的前处理和检测方法进行了回顾，以期更好地为谷物及其制品中真菌毒素的研究提供理论指导。

1 谷物及其制品的前处理方法

样品前处理技术是获得准确、可靠检测结果的前提和保障，前处理过程包括样品制备、提取、分离纯化和浓缩等步骤，以最大程度地从复杂基质中提取待测组分为目的[8-10]。

1.1 LLE技术

LLE技术利用液体混合物中各组分在两相溶剂中溶解度的差异实现净化提取[11-12]。根据相似相溶原理，乙腈/水或甲醇/水体系是常见的真菌毒素的提取溶剂[13]。LLE技术具有简单快速、易于实现、操作快速等特点，但存在有机溶剂用量大、不能满足高通量检测需求、目标物易流失等问题[11,14]。Soleimany等[15]利用乙腈-水-乙酸对稻米、小麦、燕麦、大麦和玉米粉进行提取，经LLE净化后，同时测定黄曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）、OTA、ZEN、DON、伏马毒素（FB1和FB2）、T-2毒素和HT-2毒素，方法学验证结果良好。Slobodchikova等[16]以乙酸乙酯为LLE试剂对雪腐镰刀菌烯醇、DON、AFB1等17种真菌毒素进行净化处理，既避免使用免疫亲和柱，也大大降低了基质效应的影响。杨琳等[17]对粮谷类食品中的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素用甲醇-水提取后，以LLE方式净化后，采用高效液相色谱法同时检测黄曲霉毒素和赭曲霉毒素，方法简便快速、净化效果好，结果表明各项技术指标均符合国家标准的要求。

1.2 SPE技术

SPE技术基于液相-固相色谱分离原理，首先目标物被吸附到合适的固体吸附剂上，通过淋洗使目标物与干扰组分分离，再以合适的洗脱剂将目标物从固体吸附剂上解离出来，从而达到净化与富集目标物的目的[9-10]。SPE技术具有操作简单、有机试剂用量少、适用于多残留分析等特点，目前用于真菌毒素的SPE方法主要采用反相固相萃取柱[18-20]和毒素专用固相萃取柱[21-22]。多功能净化柱（Multifunctional purification column，MFC）是一种特殊的SPE小柱，它是以极性、非极性及离子交换等几类基团组成的复合吸附填料小柱。研究表明，MFC净化过程简便快速，净化效果较好，适用于谷物及其制品中多种真菌毒素的测定[23-24]。此外，新型的分散固相萃取技术（Dispersive solid phase extraction，DSPE）也被应用于大米中多种真菌毒素的净化[25]。

1.3 QuEChERS技术

基于固相分散萃取原理建立的QuEChERS技术是一种具有快速、简单、便宜、有效、可靠、安全等特征的前处理方法，被广泛应用于多农药残留[26-27]、多兽药残留[28-29]、多真菌毒素[30-36]的检测中。QuEChERS方法的建立与优化主要从提取溶剂、盐析剂和净化剂几个方面来进行。目前，乙腈被广泛应用于多种真菌毒素的提取，而提取酸碱度、极性范围敏感的真菌毒素时，需要加入辅助试剂，如乙酸、甲酸、甲醇等以增强提取效果[37-39]。Zhang等[38]建立了一种基于QuEChERS前处理技术同时测定谷物中多种真菌毒素的高效液相色谱-电喷雾串联质谱法，结果表明所建立的方法快速、可靠、简便、灵敏，适用于谷物中多毒素的同时测定。Sospedra等[39]采用改良的QuEChERS技术对小麦粉中多种毒素进行净化处理，结果表明该方法具有较好的回收率，能满足小麦粉中多种真菌毒素的检测。QuEChERS前处理方法需要使用吸附剂，在降低基质干扰的同时，也存在吸附目标物进而使回收率降低的可能性。此外，经QuEChERS技术提取后，提取液中可能会存在共萃取杂质对光学检测器灵敏度产生影响，进而影响结果的准确性。

1.4 GPC技术

GPC技术基于物质分子量大小，利用体积排阻机理，使分子质量不同的目标分析物被具有分子筛性质的固定相分离。样品中脂肪、色素等大分子杂质被淋洗出来，在一定程度上降低了大分子基质的干扰[40-41]。刘家阳等[42]将全自动凝胶渗透色谱仪应用于玉米粉中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等10种真菌毒素的净化过程中，经验证该方法具有较好的准确性和重现性，适用于玉米粉中多种真菌毒素的快速测定。宫小明等[43]以GPC技术对花生、粮油产品进行净化处理后，利用同位素稀释法对样品中18种真菌毒素同时测定。研究表明，所建立的检测技术适用于多组分真菌毒素低含量的定性确证和定量检测，满足国际上对真菌毒素检测的限量要求。

1.5 IAC技术

IAC技术是基于抗原抗体特异性可逆结合的原理对样品进行净化，真菌毒素IAC是一种利用免疫反应的高度特异性，以抗原或抗体的一方作为配基亲和吸附另一方，从而使样品得以净化的分离体系[9,44]。Lattanzio等[45]利用多毒素免疫亲和柱对玉米中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏马毒素等11种真菌毒素进行净化后，以液相色谱-串联质谱法对11种真菌毒素进行检测和定量分析，结果显示所测定的11种毒素的浓度均接近或低于欧盟最高允许或建议限量值，方法具有较好的适用性。由于大多数真菌毒素是弱免疫物质且相对分子质量小于1 000，目前商品化的IAC种类有限[46-49]；此外，IAC净化柱价格相对偏高，导致实际应用中具有一定的局限性[9,44]。

1.6 IMBs技术

IMBs技术将生物识别元件（如抗体）和磁性材料（如Fe3O4）偶联结合成定向固定化免疫磁珠，利用磁场作用特异性地实现样品净化、富集的目的[50]。近年来，IMBs技术因具有简单快速、特异性强的特点，被成功应用于水样、食品、中药材中真菌毒素的净化[51-55]。雷方等[56]通过优化免疫磁珠定向偶联法制备出可同时净化小麦中玉米赤霉烯酮、T-2毒素等8种真菌毒素的免疫磁珠，所开发的免疫磁珠亲和纯化-液相色谱串联质谱法适用于小麦中多种真菌毒素的同时检测。由于目前商业化生产优质的免疫磁珠主要靠国外进口，价格昂贵，这在很大程度上限制了IMBs技术的应用。

2 谷物及其制品中真菌毒素的检测

目前，谷物及其制品中真菌毒素检测技术主要有快速检测和确证检测两种方法。两类检测方法在现场快速筛查和试验室仲裁检测形成互补，为防范真菌毒素安全风险提供一定的技术支撑[10,57]。

2.1 TLC法

TLC法是较早应用于真菌毒素检测的色谱技术[11]，也是很多实验室检测真菌毒素的常规手段。Hadiani MR等[58]采用TLC法分离鉴定玉米中玉米赤霉烯酮，方法检出限可达到100 ng/g，且分离效果良好。由于TLC技术存在试剂消耗量大、前处理过程繁琐、重现性和灵敏度不高等问题，不能满足现代食品检测高灵敏度、高准确度、高自动化的要求。目前TLC方法与其他分离技术联用逐渐成为一种趋势，从而建立起一种更有利于定性分析和定量检测的手段[59-60]。

2.2 ELISA法

ELISA是一种特异性强、灵敏度高、成本相对较低的分析方法，而ELISA法是真菌毒素检测中常用的一种免疫分析方法[61]。Kadota等[62]建立了一种基于表面等离子体共振的免疫分析方法，用于检测小麦中血腐镰刀菌醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，结果表明该方法测得的结果与液质测定结果一致。在实际检测过程中，有学者提出，ELISA法可能出现假阳性结果，不能进行定量分析，常被作为初步筛选手段用于现场检测筛查[63-65]。

2.3 GC-MS/MS法

GC及GC-MS/MS技术适用于分析热稳定、易挥发的化合物，而多数真菌毒素稳定性好且不易挥发，因此该方法有一定的局限性，主要适用于单端孢霉烯族化合物的检测[64,66]。Rodríguez-Carrasco等[67]利用改良的QuEChERS方法对小麦粗粉进行前处理后，首次将气相色谱-三重四级杆质谱仪应用于展青霉素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素等10种毒素的测定中。结果表明，他所建立的GC-MS/MS方法适用于小麦粗粉中多毒素的检测，方法的定量限低于10 μg/kg，应用于实际样品的结果表明，方法的可检测浓度低于真菌毒素所允许的最大水平，满足分析要求。

2.4 LC法

LC法具有高分离性能、高灵敏度、不易受基质干扰等特点，结合紫外检测器、荧光检测器或蒸发光检测器可应用于真菌毒素的检测。谢刚等[68]采用全自动免疫亲和在线净化技术对玉米、小麦中赭曲霉毒素A进行前处理后，以液相色谱法进行测定，所建立的方法满足谷物中赭曲霉毒素A的快速定量检测。Bascarán等[69]经免疫亲和萃取牛奶中赭曲霉毒素A后，利用液相色谱-荧光检测法对赭曲霉毒素A含量进行测定。Wang等[70]在无衍生化处理的情况下，利用液相色谱-蒸发光散射法对玉米中伏马毒素B1、B2、B3、B4进行测定，方法检测限达3 mg/kg。目前，LC技术主要用于单一化合物或同一类型的真菌毒素的检测，在多类型真菌毒素同时检测时具有一定的局限性。

2.5 LC-MS法

LC-MS技术将液相色谱与质谱结合起来使用，既具有液相色谱仪的灵敏度高、分离性能高等特点，也具有质谱仪很强的结构解析及组分鉴定能力，实现了色谱高分离能力和质谱强鉴定性能的优势互补，使LC-MS技术成为一种灵敏、高效、快速的检测手段。目前，液质联用技术被广泛用于多目标毒素及代谢物的检测[71-76]。鉴于LC-MS的特点，该技术已成为食品中多目标毒素及代谢物检测的定性确证和定量分析的重要手段。Zachariasova等[36]利用液相色谱-高分辨质谱联用技术分析了谷物中多种镰刀菌毒素，同位素内标和基质配标均被用于定量分析中，采用飞行时间质谱和Orbitrap两种高分辨质谱技术应用于谷物中11种镰刀菌毒素的测定。高敬铭等[48]采用复合免疫亲和柱对粮食中的6种真菌毒素进行净化后以液相色谱质谱联用技术进行同时检测，方法定量准确、快速、灵敏度高，适用于大米、小麦等粮食中多种真菌毒素的定性定量检测。刘拉平等[71]采用SPE净化结合溶剂萃取技术，利用液相色谱-串联质谱法在电喷雾负离子模式下对粮食中的ZEN和DON两种毒素同时测定，实现了粮食产品中ZEN和DON毒素的同步快速分析。

3 小结

真菌毒素是产毒真菌在适宜条件下产生的小分子有毒次级代谢物，其强毒性和高污染频率成为影响谷物及其制品产业发展的重要原因。因此，建立高效的样品前处理方法及快速准确、高通量的多目标毒素检测手段成为谷物及其制品中真菌毒素定性确证和定量分析的研究重点，也为切实保障“舌尖上的安全”提供一定的技术支持。