应用噬菌体控制假单胞菌的研究进展

刘婷 温慧 满都拉 陈忠军 孙子羽

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018)

假单胞菌属细菌是一类在自然界分布十分广泛的微生物，在自然界以及生物体中都可见到，由其引起的感染在世界范围内对人类造成了相当大的发病率和死亡率。假单胞菌属细菌不仅可以感染人类，而且也是密集饲养的皮毛动物、水产养殖类动物和植物的致病菌，也是肉类、乳制品、蛋类等蛋白质食物的污染菌。

假单胞菌属是一个异质性很强的属，利用传统的生理生化方法已满足不了此属微生物的分类。目前，主要是通过核酸杂交技术、(G+C)mol%含量测定和核酸序列分析等分子生物学的手段对其进行分类，其中利用16S rRNA序列分析是最常用的分子生物学方法。根据16S rRNA 序列的研究对假单胞菌属分成以下7个组：铜绿假单胞菌组、荧光假单胞菌组、恶臭假单胞菌组、丁香假单胞菌组、施氏假单胞菌组、绿针假单胞菌组和穿孔素假单胞菌组[1-2]。目前就假单胞菌属中研究最多的是铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌是条件致病性细菌，可引起许多严重的急、慢性感染，由其引起的肺炎、感染性休克、尿道、胃肠道感染和烧伤患者皮肤和软组织等感染对人类造成了非常大的危害[3]，并且也是污染肉制品、凉拌即食食品、饮用水等食品的致病菌和腐败菌[4]。除铜绿假单胞菌以外，其他假单胞菌也可引起严重的感染[5]。如变形假单胞菌可引起香鱼类水产养殖动物的细菌出血。荧光假单胞菌是松材线虫携带的主要致病菌[6]，也可引起冷藏食品的腐败同时也是一种罕见的人类机会致病菌[7]。丁香假单胞菌是植物的致病菌，常引起植物的病变[8-9]。恶臭假单胞菌是鱼的一种致病菌也会引起食物中毒和人类感染[10-11]。

假单胞菌本身细胞结构特点和抗生素滥用，导致其抗药性严重，抗生素防治困难，运用噬菌体来控制假单胞菌将是一种新型手段。本文就假单胞菌噬菌体在食品、水产、植物、医疗领域的研究做一综述。

1 噬菌体

噬菌体被定义为感染细菌的病毒。1917年加拿大微生物学家D'Herelle首次提出了噬菌体的概念[12]。到目前为止，噬菌体被认为是地球上最丰富最多样化的微生物[13]。2011年，国际病毒分类委员会根据噬菌体病毒核酸类型、基因组、基本特性、形态结构以及宿主菌种类等特征将噬菌体进行了最新分类[14]。报告中所包含的噬菌体绝大多数是dsDNA噬菌体，而ssDNA、dsRNA和ssRNA噬菌体所占比例则相对较少。噬菌体在大多数环境中都普遍存在，包括人体皮肤，口腔和胃肠道等[15]。迄今分离的大多数噬菌体对其宿主而言具有相对高的特异性，不会触及其他微生物菌群，这是噬菌体独特的性质。其次噬菌体可以自我复制和自我限制，也就是说只要有宿主存在，低或单一剂量的噬菌体会成倍增加，使它们的抗菌素效应也成倍增加。噬菌体本身具有的防御机制，可以不断地适应环境，在非常恶劣的环境条件下仍然具有很强的感染性，往往会继续繁殖，直至宿主细菌的种群密度显著降低[16-17]。噬菌体主要由核酸和蛋白质组成，因此噬菌体不会感染真核细胞[18]。噬菌体的这种优势降低了危害人体天然微生物菌群的风险，并消除了与化学抗生素相关的副作用、残留。无论是噬菌体，还是噬菌体编码的裂菌蛋白或噬菌体传送的CRISPR系统都可以用来防控细菌、耐药细菌的感染[19]。除了使用噬菌体来治疗人类细菌性疾病，使用噬菌体制剂来治疗由细菌引起的动物性[20]和植物性[21]疾病也引起了人们的重视，并且也正在开发一种使用噬菌体控制食物中的致病菌和腐败菌的新型治疗手段[22]。目前，铜绿假单胞菌噬菌体、荧光假单胞菌噬菌体、变形假单胞菌噬菌体和丁香假单胞菌噬菌体等都已经在各个领域中有了一些应用。因此运用噬菌体来预防和控制假单胞菌将会有很大的潜力。

2 噬菌体防控假单胞菌属细菌的应用研究

2.1 在食品领域

微生物是影响食品品质的重要因素，在食品加工、运输和贮藏过程中特别容易腐败变质，这不仅影响食品的色香味而且也会导致食品污染甚至引起食品安全事故。目前化学防腐剂在食品工业生产中应用最多。但是化学防腐剂对人体存在很多潜在的危害，并且在食品生产工业中的应用也存在着不足，应用于食品工业中的这些化学防腐剂大部分没有经过科学而全面的筛选，而且化学防腐剂的滥用和过量使用对消费者的身体健康造成了很大的危害，这已经引起了消费者对食品安全的重视[23-24]。所以，在食品领域需要研发一种绿色的、无毒无害的、应用前景良好的产品来防控和抑制微生物的影响。而噬菌体就是一个很好的选择。

随着生活水平的提高，乳制品已经是一种不可或缺的食品。假单胞菌是原料乳中一类主要的嗜冷菌，原料乳中的假单胞菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌等。荧光假单胞菌可以在低温环境下生长繁殖，如果低温冷藏条件下的原料乳被荧光假单胞菌感染[25]，该菌便会大量繁殖，并且逐渐变为优势菌群。引起原料乳变质，使乳制品的口感与安全受到威胁[26]。Sillankorva等[27]以控制原料乳中假单胞菌为目标对荧光假单胞菌噬菌体ΦIBB-PF7A做了生理特性和基因组信息等研究。胡子毅等[28]从原料乳中分离筛选假单胞菌噬菌体，试验结果显示，不论在4℃还是在25℃条件下，噬菌体均能有效地在液态乳体系中控制假单胞菌的生长，同时还能显著降低原料乳中的嗜冷菌数以及细菌总数并延缓细菌的生长速度。Hu等[29]从污水中分离出13种针对13种假单胞菌菌株的新型裂解噬菌体，试验结果同样表明，具有不同形态和生理特征的13种噬菌体可以有效控制生乳中假单胞菌的增长。假单胞菌不仅是乳品中的主要优势菌群。在有氧的条件下，假单胞菌菌也是导致肉品腐败的主要优势菌群[30]。Greer[31]从冷却牛肉中分离出假单胞菌噬菌体，试验显示假单胞菌噬菌体可以有效延长冷却零售牛肉的货架期。在国内，对肉中假单胞菌生长模型的研究比较多，而对其相应噬菌体的研究还比较少有待于进一步研究。平菇、双胞蘑菇等食用菌是我国食用量很大的菇类，但是由于托拉假单胞菌所引起的细菌性斑点病不仅会降低这些菇类的产量，也会影响食用品质[32]。Kim等[33]从污水中分离出来了托拉假单胞菌噬菌体，试验结果显示噬菌体可以杀灭蘑菇组织中的病原菌，减少作物损失。食品致病菌和腐败菌产生的巨大负面影响使得控制食品微生物污染的需求得到加强。使用噬菌体作为天然抗菌剂在控制食物病原体和腐败微生物方面具有巨大的潜力。噬菌体适用于从农场到餐桌的每个环节，不论是食品加工设备还是食品运输过程都可以使用噬菌体来进行防控，噬菌体也可以作为食品中的天然防腐剂，延长产品的保质期，保证食品质量[22,34]。噬菌体制剂在食品领域的研究越来越多，并且已经有很多噬菌体制剂用于食品中。

2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)为了控制单增李斯特菌的污染批准了ListShieldTM噬菌体产品可作为食品添加剂，相继又有许多其他噬菌体鸡尾酒产品(单增李斯特菌属，沙门菌属和大肠埃希菌属等)被批准应用[35-36]。市售的假单胞菌噬菌体有 Omnilytics有限公司针对丁香假单胞菌的Agriphage噬菌体产品。Brimrose科技公司的针对铜绿假单胞菌的Pyo-bacteriophage和Intesti-bacteriophage噬菌体产品。我国虽然没有批准应用的噬菌体产品，但是在使用噬菌体制剂来保障食品品质和安全方面已经有了不错的成绩。

2.2 在水产养殖领域

随着经济的发展，人类对海洋食品需求的增加，水产养殖业迅猛发展，但是由细菌和病毒感染所引起的疾病越来越严重，导致水产养殖部门遭受了巨大的经济损失。而抗生素在水产养殖中的大量使用，对人类和动物的健康以及对环境的破坏也日益严重[37]。在这种情况下，高效环保的噬菌体疗法正发挥着作用。

影响水产养殖的主要假单胞菌属细菌有变形假单胞菌和铜绿假单胞菌。变形假单胞菌是革兰阴性菌，在自然环境中常见。变形假单胞菌可引起香鱼、大黄鱼等水产养殖动物的细菌出血性败血病，造成非常大的损失[38]。

Park等[39]在患有败血病的香鱼组织内和养殖香鱼的池水中筛选出了两株变形假单胞菌的噬菌体。在噬菌体治疗试验中，香鱼被喂养含有变形假单胞菌的饲料，然后再分成4组分别喂食含有单一噬菌体、2种噬菌体混合制剂和不含有噬菌体浸渍的饲料。香鱼的死亡率分别为53.3%、40.0%、20.0%和93.3%。试验表明2种单一噬菌体对变形假单胞菌的抑制效果不同，但是含有2种噬菌体的混合制剂效果最佳。随后Kawato等[40]对Park等[39]之前筛选出的变形假单胞菌噬菌体的基因组序列进行分析，结果再次验证了之前Park等[39]的试验结果，这两种裂解噬菌体可以用作噬菌体制剂。因此，运用噬菌体制剂来有效控制香鱼细菌性出血性败血病是一种较好的选择。而引起鲶鱼物种溃疡性病变的致病性细菌是铜绿假单胞菌。Khairnar等[41]运用噬菌体疗法在8～10d内有效的治愈了被感染鱼的溃疡性病变，与未治疗的鱼相比感染降低了7倍。由此可知噬菌体疗法也可以用于治疗鱼类溃疡性病变。作为水产养殖中抗生素处理的替代或补充，噬菌体治疗可能很快就会有潜在的应用。

2.3 在植物领域

植物细菌性疾病一直是影响农业发展的灾害之一，而由丁香假单胞菌引发的植物病害发生率居十大细菌性植物病害之首[42]。

丁香假单胞菌是猕猴桃细菌溃疡的致病因子，它给猕猴桃种植带来了严重的经济损失，然而采用传统方法未能充分控制丁香假单胞菌的感染。Lallo等[43]从受感染的叶子和污水中分别分离筛选出噬菌体fPSA1和fPSA2，其中fPSA2是毒性噬菌体，可以感染所有丁香假单胞菌测试菌株。试验结果为噬菌体治疗猕猴桃细菌性溃疡提供了一定的研究基础。

丁香假单胞菌也是引起韭菜细菌性枯萎的致病因子，由于缺乏有效的控制措施，导致韭菜栽培出现了严重的问题。Rombouts等[44]从受感染的田中分离出5种新的噬菌体分别为vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3、vB_PsyM_KIL4和vB_PsyM_KIL5。试验中又加入另一种噬菌体vB_PsyM_KIL3b。经特异性生物测定结果证明了噬菌体vB_PsyM_KIL1、vB_PsyM_KIL2、vB_PsyM_KIL3和vB_PsyM_KIL3b在植物治疗中的功效。此外，使用6种噬菌体混合物在田间试验，试验结果显示噬菌体混合物可以控制韭菜细菌性枯萎病。

以上这些都可以表明噬菌体疗法在植物病害防治方面有一些潜力，但后期需要在配方和应用方法上面进行优化。噬菌体具有替代抗生素和化学药品的潜力，商业化的丁香假单胞菌噬菌体产品已被用于植物疾病的防治[45]。

2.4 在医学领域

出于安全性的考虑，假单胞菌噬菌体的试验主要在动物模型中进行。在皮肤，角膜炎，肺部等感染模型中的治疗都已经有了非常显著的效果。Debarbieux等[46]使用生物荧光铜绿假单胞菌菌株监测和量化噬菌体治疗急性肺部感染小鼠的功效。结果显示噬菌体治疗不仅能有效地使动物免受致命性感染，而且在细菌感染前24h注入还可以预防肺部感染。Furusawa等[47]使用噬菌体来治疗马细菌性角膜炎，在角膜炎小鼠模型中，3h内施用噬菌体可以杀死细菌并抑制角膜炎。研究结果显示噬菌体可完全预防由铜绿假单胞菌引起的角膜炎。除了使用小鼠做试验，Beeton等[48]使用的蜡螟模型试验也取得了成功。他们使用实验室铜绿假单胞菌菌株PA01去感染蜡螟幼虫，并且在感染前2h和感染后2h把不同感染复数的噬菌体注射到幼虫血淋巴中。结果表明，感染24h后，噬菌体使血淋巴中的细菌细胞数量比未处理组低1000倍。Gu等[49]从水貂中分离纯化出YH30噬菌体。宿主范围测定显示YH30对所有测试的铜绿假单胞菌菌株都具有感染性，试验结果也显示YH30噬菌体可以有效治疗铜绿假单胞菌引起的出血性肺炎。这些试验均扩大了噬菌体作为治疗药物的潜在用途。

铜绿假单胞菌是医院内获得性感染的重要致病菌。据估计，由烧伤所引起的死亡中至少有一半是因为感染了铜绿假单胞菌，并且感染铜绿假单胞菌的患者大多不可治愈[50]。铜绿假单胞菌一般情况下对多种抗生素耐药，已被加入了“超级细菌”的行列[51]。抗生素已经无法达到理想的治疗效果。而且在过去的30多年里，也一直没有开发出新型的抗生素来治疗铜绿假单胞菌所引起的病变。因此，需要制定新的预防和治疗策略来控制烧伤患者的细菌性感染和铜绿假单胞菌耐药性日益增多的现象，其中一种安全有效的方法就是噬菌体疗法[52]。

1958年，我国第一位细菌学博士余㵑教授[53]在上海应用自制的铜绿假单胞菌噬菌体成功治愈了全国著名劳模邱财康的大面积烧伤，保全了他的肢体。这为我国铜绿假单胞菌噬菌体疗法用于临床中提供了研究依据。Marza等[54]用噬菌体成功治疗了由铜绿假单胞菌感染的烧伤患者，并且在患者伤口感染处没有分离出铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌不仅可以引起烧伤患者感染也是引起慢性中耳炎的病原菌。Wright等[55]使用噬菌体制剂治疗铜绿假单胞菌引起的慢性中耳炎，试验选取了24位持续患有慢性中耳炎2～58年的患者。参与者被随机分为两组，每组12人进行对照试验，试验结果表明噬菌体治疗组患者的临床各项指标得到改善且铜绿假单胞菌数量明显降低，且并未发现任何的不良反应。对于治疗多重耐药性铜绿假单胞菌的感染，噬菌体制剂的临床试验结果显示出了很好的疗效同时也具有安全性。

3 总结与展望

目前，抗生素类药品在防治腐败菌和致病菌方面仍占有主导地位，但是由于抗生素的大量使用，也使得细菌的耐药性不断增强，甚至出现了“超级细菌”。而噬菌体作为一种新型的抗菌制剂与抗生素等抗菌剂相比在抗菌方面更适合长期的使用。噬菌体在替代化学防腐剂和抗生素方面有很多的优点，也取得了巨大的成功，但是在食品、水产、植物甚至医药行业等领域应用还是有很大的阻碍。例如噬菌体的抑菌谱比较窄、以及噬菌体的安全性等问题都需要进一步研究验证，但是随着基因工程技术的不断成熟，以及噬菌体与其他抗菌制剂的联合使用[56]。使得噬菌体的研究和应用得到了进一步的发展，也解决了很多噬菌体可能带来的安全隐患问题。国外商业化的噬菌体生物制剂在不断增多，并且我国近些年来对噬菌体的关注也越来越多，噬菌体在不同领域的研究也取得了很多成果，我们应进一步深入地去研究并促进噬菌体制剂在各个领域中的发展应用。最后需要强调的是，如果有一天噬菌体被广泛用于不同领域的时候，我们应该注意不要过度使用，抗生素就是一个很好的例子。