海洋石油降解菌Halomonas sp.DH1产生物表面活性剂的性能

刘 颖， 徐薇薇， 郭 平， 林建国

(1. 中国航海学会，北京 100013； 2. 大连海事大学 环境科学与技术学院，辽宁 大连 116026)

日益频发的海洋溢油事故使海洋环境遭到严重的破坏[1]，发生在低温条件下的溢油事故往往危害更大。[2]1989年3月24日，Exxon Valdez油船在阿拉斯加州美、加交界的威廉王子湾附近触礁，约1 700 km的海岸带被污染，大约有10万～30万只鸟[3]和大量海獭、海豹、秃鹰、鲑鱼和鲱鱼死亡[4]，对生态系统的影响至今还没有完全消除。[5]我国北方海区是重要的石油开发区，随着海上石油平台和油码头的陆续投产，往来船舶大量增加，成为溢油事故的多发区。海水温度较低时，在我国北方海域也曾发生多起溢油事故，如1983年11月25日发生的“东方大使”轮触礁事故[6]、2004年11月28日发生的“锦集7”沉船事故[7]和2002年11月23日发生的“塔斯曼海”油船碰撞事故[8]。这些事故发生时海水温度较低，不利于对石油污染的清除，对海洋环境造成严重危害。因此，研究低温时石油污染的处理方法对保护我国北方海域十分必要。

常用的处理石油污染的方法有物理方法、化学方法和生物方法，其中生物方法具有安全、高效、无二次污染、不需大型设备等优点。[9]但是在低温条件下，石油烃的生物可利用性降低。[10]尽管低温不利于石油烃的生物降解，但自然界存在能够降解石油烃的低温石油降解菌[11-14]，并且有些低温菌能够通过产生生物表面活性剂来提高石油烃的生物可利用率。[15]生物表面活性剂同时具有亲水基和疏水基，能显著降低油/水界面张力[15-17]，促进石油烃溶解、乳化、分散等，提高石油污染生物修复的效率。[17-19]同时，生物表面活性剂具有对环境影响小、可原位生成等优势，适用于环境修复。

目前对产生表面活性剂的海洋石油降解菌的研究主要集中在常温菌，对低温菌的研究较少，特别是对筛选自海洋环境的表面活性剂的低温菌株研究非常少。[20-21]本研究利用筛选自我国北方海域的石油降解菌进行生物表面活性剂的制备，并对所产生的生物表面活性剂的性能进行研究。

1 试验材料与方法

1.1 培养基与菌株

试验中用到两种液体培养基：MMC培养基和2216E培养基。

1) MMC培养基组分：NaCl，24 g；NH4NO3，1.0 g；KCl，0.7 g；KH2PO4，2.0 g；Na2HPO4，7.563 4 g； MgSO4·7H2O，7.0 g；微量元素；去离子水，1 000 mL；pH值为7.4，在121 ℃下高压灭菌20 min。

2) 2216E液体培养基组分：蛋白胨，5 g；磷酸高铁，0.1 g；酵母膏，1 g；去离子水，1 000 mL；pH值7.4～7.8，在121 °C下高压灭菌20 min。

试验菌株为实验室现有菌株。该菌株分离自大连近岸海域表层海水，经16S rRNA基因测序方法鉴定该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas)，命名为Halomonassp.DH1。该菌株能在低温下降解石油烃，在10 ℃下降解培养60 d后，菌株对原油的降解率可达49.7%。

1.2 Halomonas sp.DH1的培养

用无菌接种环挑取纯化后的菌株至装有100 mL已灭菌的2216E液体培养基的三角瓶锥形中，低温振荡培养 3 d(10 ℃，120 r/min)形成降解菌母液。

1.3 Halomonas sp.DH1利用不同碳源产表面活性剂

分别利用葡萄糖、正十六烷、柴油、原油、石蜡、菲、萘、芘为碳源，考察Halomonassp.DH1利用不同碳源产表面活性剂的情况。

按照5%(体积分数)的比例将降解菌母液移至已灭菌的MMC液体培养基中，然后分别加入1%(体积分数或质量分数)的碳源。在10 ℃条件下低温振荡培养20 d。以不接种降解菌的培养液作为空白组。

降解培养结束后，发酵液离心去除菌体后用盐酸调节至 pH = 2.0，在4 ℃下冷藏过夜。使用表面张力仪测定发酵液的表面张力。在试管中加入6 mL离心去菌后的发酵液和4 mL柴油，涡旋振荡2 min，静置24 h后测量乳化层高度和总高度。乳化指数(E24)=乳化层高度/总高度。

1.4 用Halomonas sp.DH1制备生物表面活性剂

按照5%(体积分数)的比例将降解菌母液移至含有1%(体积分数)柴油的MMC液体培养基中，在10 ℃条件下低温振荡培养20 d。发酵液离心去除菌体后用盐酸调节至pH=2.0，在4 ℃下冷藏过夜。用氯仿-甲醇(2∶1，体积分数)混合液萃取发酵液中的表面活性剂，将萃取液旋转蒸发后得到物质为生物表面活性剂。

1.5 生物表面活性剂的性能

1.5.1对柴油生物降解的促进作用

按照5%(体积分数)的比例将降解菌母液移至含有1%(体积分数)柴油和5%(体积分数)生物表面活性剂的MMC液体培养基中，在10 ℃条件下低温振荡培养20 d。以不加生物表面活性剂的培养液作为对照。

降解培养结束后，用石油醚萃取发酵液中残余的石油烃，在波长225 nm下采用紫外分光光度法测定石油烃含量。将水相稀释5倍后在波长600 nm下采用可见光分光光度法测菌株生长情况。

1.5.2对黏附在沙子上原油的洗脱作用

将1.5 g原油加入到装有7.5 g沙子(沙子取自大连市星海浴场沙滩)的三角瓶中，振荡使原油与沙子充分混匀，放入干燥箱后烘干3 d。取20 mL 浓度为0.1 g/L的生物表面活性剂溶液加入到装有含油沙子的三角瓶中。将三角瓶充分振荡后倒掉水相，放入干燥箱后烘干，称重。对照组用20 mL 去离子水代替生物表面活性剂溶液。

原油的洗脱率=(洗脱的原油重量/黏附的原油重量)×100%。

2 试验结果与讨论

2.1 Halomonas sp.DH1利用不同碳源产表面活性剂

菌株Halomonassp.DH1利用不同碳源的发酵液的表面张力和E24见图1。试验结果表明Halomonassp.DH1菌株以正十六烷、液体石蜡、柴油为碳源的情况下，发酵液的表面张力较低，其中以正十六烷为唯一碳源的发酵液可将表面张力降低至28.4 mN/m。以葡萄糖、正十六烷和萘为碳源时发酵液的乳化性能较好，E24分别达到60.1%和51.1%。这说明菌株Halomonassp. DH1以这些物质为碳源进行发酵所得的发酵产物具有得到较好的表面活性。

许多菌株能够利用不同的碳源产生表面活性剂，例如VARJANI等[22]学者研究菌株Pseudomonas aeruginosa NCIM 5514对不同碳源的利用情况：该菌株在利用柴油、原油、甘油和葡萄糖为碳源时发酵液的表面张力显著降低，分别为38.00 mN/m、36.70 mN/m、34.95 mN/m和29.42 mN/m；在利用甘油和葡萄糖为碳源时发酵液的乳化性能较好，E24分别达到75.0%。研究目的的不同对碳源的选择也不同。研究生物表面活性剂原位生成时往往选用原油、燃料油、柴油等碳源，研究生物表面活性剂生产的经济性时往往选用废油或其他价格较低的碳源。

2.2 用Halomonas sp.DH1制备生物表面活性剂

在柴油降解的初期，摇瓶内的柴油呈膜状漂浮在水面上，水相澄清。随着时间的延长，水相开始逐渐变浑浊，柴油呈油滴状。随着培养时间的进一步延长，柴油液滴越来越小直至液面上无明显油滴，液相呈乳白色。发酵液离心去除菌体后用盐酸调节至pH=2.0，在4 ℃下冷藏过夜，无沉淀产生。用氯仿-甲醇(2∶1，体积分数)混合液萃取发酵液中的表面活性剂，将萃取液旋转蒸发后得到物质为棕黄色粉末。

目前生物表面活性剂的制备方法主要有微生物发酵法和酶合成法，由于生物表面活性剂的分子结构种类相对较多而且比较复杂，传统的化学方法不容易合成。

2.3 生物表面活性剂的性能

2.3.1对柴油生物降解的促进作用

降解培养结束后，加入表面活性剂的摇瓶内溶液较未加入表面活性剂的溶液更加浑浊。试验结果见图2，可见加入表面活性剂明显促进菌株的生长和对柴油的降解效果。加入表面活性剂的摇瓶内柴油的生物降解率比未加入表面活性剂的高22.3%。

许多研究表明加入生物表面活性剂能促进石油烃的降解，主要是由于生物表面活性剂降低难溶的石油烃与水之间的界面张力， 有利于石油烃的分散、乳化和溶解，增大相界面面积, 便于石油降解菌和油滴之间直接接触， 加速石油烃向细胞中的扩散和被同化分解。[23]

2.3.2对原油的洗脱作用

Halomonassp.DH1所产生的生物表面活性剂能显著洗脱沙子上黏附的石油烃。洗脱前后的照片见图3，可见使用生物表面活性剂洗脱原油后，大部分黏附在沙子上的原油被洗脱，沙子露出本色，溶液浑浊，而使用去离子水洗脱原油后，沙子依然黏附黑色原油，水相较澄清。用20 mL浓度为1 g/L的生物表面活性剂溶液可将沙子上黏附的原油洗脱82.1%，而在同等条件下使用去离子水仅可洗脱掉11.7%的原油，可见加入生物表面活性剂显著促进了原油的洗脱效率，见图4。说明菌株Halomonassp.DH1所产生的生物表面活性剂具有应用于潮间带石油污染生物修复的潜力。

a) 用去离子水洗脱b) 用表面活性剂溶液洗脱

图3 原油的洗脱效果照片

3 结束语

本研究对海洋低温石油降解菌Halomonassp.DH1产生物表面活性剂的性能进行了研究。试验结果表明：在低温下菌株Halomonassp.DH1可利用多种碳源产生表面活性剂，产生的生物表面活性剂可显著促进石油烃的降解和洗脱。因此，该菌株具有应用于我国北方海域冬季溢油生物修复工作的潜力。

本研究的结果可以为海洋溢油的微生物修复提供优良菌源和基础数据。但论文中很多的研究工作还处于初始阶段，未来应进一步深化研究。