压载水常见致病菌垂直分布特征与水龄的关系

李良广, 朱鸣鹤, 熊志松， 钱 程

(宁波大学 海运学院， 浙江 宁波 315211)

21世纪以来，世界各国贸易发展迅猛，船舶进出港口频繁，由压载水随意排放引发的海洋生态环境恶化、物种变异甚至生物入侵等一系列问题， 已被全球环境联合会(Global Environment Facility, GEF)认定为世界海洋的四大威胁之一。[1]据统计，每年至少有超过7 000种海洋动物、植物以及病原微生物随压载水转运至世界各地。[2]而在各入侵的物种中，压载水微生物以其流动性强、变化规律复杂以及不能及时有效处理的特性对入侵环境构成更严重的威胁。目前对压载水的调查研究工作已逐渐深入。文献[3]～文献[6]对压载水中藻类、细菌与盐度、溶解氧、温度及pH等环境因子分别展开有针对性的研究；挪威水研究所(Norwegian Institute for Water Research, NIVA)在对压载水进行分析时发现压载水中存在一些致病菌生存能力非常强，7 a后仍能表现出毒性[7]；李春丽等[8]在对到达宁波港的多艘船舶进行研究时发现包括副溶血性弧菌在内的多种致病菌。RUIZ等[9]研究发现沿海生态系统的入侵物种中，细菌和病毒的入侵成功几率远高于其他微生物。这些研究结果均证明了压载水中存在着大量的致病菌，并已对沿海地区人体健康以及生态环境构成巨大威胁。李云峰等[10]在对船舶压载舱沉积物进行检测时发现在所检出的12种细菌中大多具有致病性；REVILLACASTELLANOS等[11]和MIMURA等[12]在各自的研究中发现大量的潜在致病菌存在于压载舱底层的沉积物中。这些研究都表明了底层压载水及其沉积物中致病菌的数量以及检出率不同于其他水层且均处于较高水平，但对压载水微生物的聚集情况的研究多侧重于浮游生物[13]，对压载水中致病菌在航行中数量以及分布特征变化情况也鲜有报道。

随着《船舶压载水及沉积物控制和管理国际公约》(以下简称“压载水公约”)于2016年11月24日正式生效，其对含有常见致病菌(大肠埃希菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌)的压载水的排放制定了严格的标准，这对我国的压载水的管理提出了更高要求，所以对压载水的系统性研究迫在眉睫。本文通过研究压载水中3种常见致病菌的垂直分布特征及与水龄的关系，为压载水生物入侵风险评价、物种快速检测方法研究以及压载水处理设备研发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

采自2016年3月至2016年8月进入上海港的DEMETER、LISA和TINA 3艘分别装自地中海、印度洋和波斯湾3个海域的国际船舶的7个水舱的压载水水样见表1。

表1 采样船舶统计

1.2 方法

本文根根“压载水公约”的相关规定，采用10倍稀释涂布平板划线法，将样品中的致病菌培养成菌落，通过菌落的不同特征确定对应致病菌的种类，通过观察菌落的数量来完成对致病菌快速准确计数。

由于不同压载舱水深不同，按照水深分成A、B、C等3类。A类压载舱包括D1和D2，B类舱包括L1、L2、L3，C类舱包括T1和T2。各舱由压载水表面至舱底的20个不同深度点进行采样，每个点采集5～15 L水样，测试水温。现场取5～8 L不等，使用15 μm孔径的筛绢进行过滤，水质澄清后灌入采样瓶，密封并带回实验室处理。采样船舶情况如表1所示。

在实验室中取得压载水样品之后，对其进行1∶10稀释，得到稀释溶液(尽量使得样品中的细菌细胞分散开，即成为单个细胞存在，以保证1个菌落代表1个细胞)，从稀释溶液中抽取一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。培养8 h后，形成菌落，通过统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数量。另外根据不同的细菌形成菌落后存在的明显差异，可通过对菌落的形态特征观察对比来判断出细菌的种类。

经过对文献研读以及资料查找，获取了大肠杆菌菌落、副溶血性弧菌菌落和霍乱弧菌菌落的形态特征资料。

1) 大肠杆菌菌落：菌落边缘整齐，圆形，表面有光泽，湿润，光滑，呈灰白色。

2) 副溶血性弧菌菌落：圆形，边缘整齐，湿润，稍浑浊，半透明，多数具有尖心、斗笠装，蓝绿色菌落，直径为2～4 mm。

3) 霍乱弧菌菌落：菌落为黄色，扁平，直径约为2～3 mm。

4) 重复试验过程，能够获取不同水深的压载水中致病菌在不同水龄中的种类和数量数据。

采用ORIGIN 9.1软件进行绘图。采用SPSS19.0统计软件对3种致病菌数量分布与水龄做相关性分析。

2 结果与讨论

2.1 3种致病菌在压载舱中的检出情况

根据不同水深，浅层压载水A类舱取水深0～2 m，B类舱取水深度0～1 m，C类舱取水深度0～0.8 m；中层压载水A类舱取水深度4～6 m，B类舱取水深度2～3 m，C类舱取水深度1.6～2.4 m；深层压载水A类舱取水深度8～10 m，B类舱取水深度4～5 m，C类舱取水深度3.2～4.0 m。检测发现，随着水深的增加，各致病菌的检出率也呈现出逐渐增加的趋势，尤其是在对底层压载水进行检测时，3种致病菌的检出率明显增加。其中大肠埃希菌和副溶血性弧菌的检出率更明显地表现出这一趋势，底层压载水检出率分别为56%和32%，而霍乱弧菌的检出率明显低于前两者，且受深度的影响不明显。检出率情况见表2。

表2 3种致病菌在不同水深的检出率 %

压载水及其沉积物中的生物种类组成及丰度情况与载入压载水的海域中生物种类和丰度情况密切相关[14]，据此来看本研究中3艘货船压载水的载入点水域中含有数量较多的大肠杆菌和副溶血性弧菌以及数量较少的霍乱弧菌，见图1。此外，这可能也与压载舱内的生存环境更有利于大肠埃希菌和副溶血性弧菌这些优势种群的生存，从而挤压霍乱弧菌的生存空间有关。

在对各船舶进行跟踪研究时，发现目标压载舱在载入压载水前未将原先的压载水完全排除，但仍有少量残留物，通过采样分析可知：残留物中3种致病菌数量总体较少(见表3)，如D1中3种致病菌的数量分别为大肠埃希菌3.9×104cfu/mL、副溶血性弧菌2.3×103cfu/mL、霍乱弧菌2.1×103如表3所示，而与新载入压载水后3种致病菌的数量(大肠埃希菌7.23×105cfu/mL、副溶血性弧菌1.79×105cfu/mL、霍乱弧菌1.52×104cfu/mL)相比明显不在同一量级上。因此，本次试验就数量而言，残留物的中细菌不会对本次试验构成明显的影响，试验数据依然能反映其分布特征及与水龄的关系。

表3 以往残留物中致病菌数量 cfu/mL

2.2 3种致病菌在压载舱中的垂直分布

以往研究中发现封闭阴暗的压载水环境中水龄为10 d时，细菌丰度的变化已趋于稳定，且5～10 d时压载水中的浮游植物大部分已死亡或进入休眠状态[15-16]，根据这一结论，本研究以水龄10 d为时限。

如图1所示，压载舱L1中：水深0.5 m时大肠埃希菌4.76×104cfu/mL，副溶血性弧菌3.72×104cfu/mL，但为未检出霍乱弧菌；水深5 m时压载水出大肠埃希菌1.58×105cfu/mL，副溶血性弧菌8.89×104cfu/mL，霍乱弧菌1.78×104cfu/mL。数据显示出个压载舱中各水深菌落数量变化明显且深层水样中的数量明显高于表层压载水，并且压载舱L2、L3、T1以及T2均可反映出此态势，即随着水深的增加，三种致病菌数量都呈现出逐渐增加的趋势见表4。此外，从表4可看出：3种致病菌数量垂向分布与水深呈显著正相关(D1、D2除外)，这也与REVILLACASTELLANOS与MIMURA发现大量的潜在致病菌存在于压载舱底层的沉积物中这一结论相符。[11-12]

b) D2c) L1

d) L2e) L3

f) T1g) T2

图1 10 d时3种致病菌在压载舱中的垂直分布

表4 3种致病菌与水深的相关性

需要注意的是，压载舱D1和D2中的检测结果并未严格显现出“随着水深的增加，细菌数量逐渐增加”的规律，且与水深的相关性不明显，如图1所示，压载舱D1中：水深1 m时大肠埃希菌8.03×105cfu/mL，副溶血性弧菌2.09×105cfu/mL，霍乱弧菌2.11×104cfu/mL；水深10m时大肠埃希菌8.26×105cfu/mL，副溶血性弧菌1.96×105cfu/mL，霍乱弧菌1.93×104cfu/mL。从对置换压载水中致病菌的研究可知，这些存在于压载水中的大量摄食细菌的浮游生物一旦经过大洋置换排出压载舱，压载舱中的细菌丰度将会明显增加。[14]经调查发现，这可能与DEMETER在靠泊新加坡港时应港方要求，对这两个压载舱中的压载水进行了大洋置换有关，此时距压载舱D1和D2发生置换的时间仅为3 d。通过对经过大洋置换和没有经过大洋置换的压载水中致病菌的研究，SEIDEN等[17]发现，存在于压载水中的大量摄食细菌的浮游生物，一旦经过大洋置换被排出压载舱，压载舱中的细菌丰度将会明显增加。这可能是压载舱D1和压载舱D2中3种致病菌显著高于其他压载舱的原因。此外，压载水的置换行为搅动了舱中原有的水体，对压载水温度、pH、溶解氧等环境因子产生影响，继而使压载水发生置换后的短时间内，细菌的活跃性增加，浅中层水深的细菌数量上升。

从图1和表4可知：除经过大洋置换的压载水中3种致病菌的垂直分布与其他压载舱明显不同外，其他各压载舱中3种致病菌的垂直分布状况基本相同，即随着压载水深度的增加菌落数量逐渐增加，且在各水深中3种致病菌数量均是大肠埃希菌最多，副溶血弧菌次之，霍乱弧菌最少。

2.3 3种致病菌与水龄的关系

检测发现，各压载舱中底层压载水中存有数量最多的致病菌，且随着水龄的增加其数量变化明显，故在研究中着重观测底层压载水。

如图2所示，随着水龄的增加，底层压载水3种致病菌数量均发生明显的变化，其中B、C类压载舱在航行中并未发生置换，菌落数量一直呈明显增加的状态，而在水龄超过10 d时其数量已趋于稳定，如L3在水龄为1、5、10、15 d时大肠埃希菌分别为1.22×105cfu/mL、1.69×105cfu/mL、2.17×105cfu/mL、2.17×105cfu/mL；A类舱在第7 d时发生置换，其菌落数量发生明显变化，如D1在水龄为6、7 d时大肠杆菌分别为8.54×105cfu/mL、6.72×105cfu/mL，在所观测的15 d中A类舱在置换前后类似于B类、C类舱前期逐渐增加的趋势。

随着水龄的增加，3种致病菌与水深的正相关性均逐渐增强。水龄较小时，压载水中的活体生物死亡较少，细菌分布随水深变化表现出的相关性不明显。但由于压载舱的相对封闭，以及水龄的增加在压载舱中逐渐形成一低溶解氧环境，致使压载水中大量活体生物死亡并沉于压载舱底部，而大肠埃希菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌又通常以这些生物体为载体，故致病菌数量随水深逐渐增加，见图3。

船舶在港口排放压载水时不会完全排空，而是根据船舶的稳定性以及装货的情况进行排放，即使是完全排放，舱底也会约有5%的压载水残留。因此，将有一定数量的压载水经过多次排放后仍残留在压载舱中。船舶在航行过程中，压载水中的溶解氧及营养物质被其中的生物逐渐消耗，压载舱中并未设置专有的空气流通途径，只能通过压载舱顶部设置的通风口和测量孔与外界连接，死亡生物体腐烂被微生物分解，产生CO2等物质，这些促使压载水中各类化学物质的种类和浓度不断进行着复杂的变化，舱内环境的变化可能会进一步导致微生物的种类和数目发生变化。[18]但在长期观测一条船舶的压载水的过程中SEIDEN等[17]发现一些危害人体的致病菌能长期存活于恶劣的压载水环境中，且随着时间的推移，没有呈现出减少的趋势，反而会出现数量增加的情况。[16]

研究中水龄最大的为25 d，这与其他水龄为10 d时的样本中检测出的各致病菌的数量基本在一个量级上，这可能是因为水龄为10 d时压载舱内的环境变化已趋于稳定，致病菌的各生物活动也趋于稳定。此外，该研究对压载舱新加装的压载水进行15 d的跟踪检测发现，随着水龄的增加，3种致病菌数量仅在垂直分布上发生变化，且随着水中其他动植物的死亡，逐渐集中于压载舱底部，最终呈现出随水深的增加而逐渐增加，但在总数上并没有像水生动物和藻类一样呈现出减少的趋势。

b) D2c) L1

d) L2e) L3

f) T1g) T2

图2 底层致病菌随水龄的变化

3 结束语

该研究通过对3种主要致病菌在压载水中的垂直分布以及其受水龄的影响情况得出：

1) 水龄>10 d时，在封闭阴暗的压载水环境中，时间因素对3类致病菌总数的影响不明显。致病菌的数量并未像水生动植物一样随着时间的增加而呈现出减少的趋势，而是在总数上处于稳定的状态。

2) 压载水中3种致病菌的分布具有鲜明的特点，即随压载水深度的增加菌落数量与检出率逐渐增加，且随时间推移此态势明显加强，其间若发生压载水置换行为或水龄<10 d时则这一势态不明显。

3) 根据上述研究结果，在对水龄较长的压载水进行处理时，仅需对压载舱底层压载水和沉积物进行处理，便能在大大减少压载水的处理量的同时实现对压载水的有效管理。此外，在评估压载水排放是否达标时应重点监测舱底的压载水和沉积物。

目前对压载水致病菌的研究依然有待深入，未来研究方向可以是对以往压载舱残留物中的致病菌进行跟踪调查以探究其在压载水转运过程中对新载入压载水的影响情况，或是对压载舱沉积物中各种致病菌来源与变化情况或是对温度、盐度、pH及溶解氧等多种环境因子影响下3种致病菌的动态变化情况进行深入探究，以实现对压载水中致病菌的科学管理。