肿瘤源性外泌体与白血病关系的研究进展

田翔宇，陈奎生

0 引言

白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病。白血病细胞因增殖失控、分化障碍以及调控受阻等原因而停滞于细胞发育的不同时期。外泌体（exosomes）是一类由细胞膜和多囊泡体（multivesicular bodies, MVB）融合形成的磷脂双层膜结构的囊泡小体，可携带多种mRNA、蛋白质及微小RNA等，广泛存在于血液、尿液、唾液等各种体液中[1-2]。随着近年来研究的不断深入，发现外泌体可通过影响细胞增殖、凋亡和自噬、调节骨髓微环境、促进血管生成以及抑制骨髓造血等方面促进白血病的发生发展，导致白血病的耐药。同时外泌体也可作为白血病药物治疗的作用靶点。本文就以上几方面作一综述。

1 外泌体的生物学特征

外泌体直径约30～150 nm，密度1.13～1.19 g/ml，外泌体膜上含丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺和脂质。大部分外泌体内含热休克蛋白（HSP70、HSP90）、四次膜蛋白超家族（transmembrane 4 super family, TM4SF）成员（CD9、CD63、CD81、CD82等）、多囊泡相关蛋白（Alix、TSG-101）及膜转运融合蛋白（Rab GTPase、lotillin）。另外，外泌体所含蛋白质与细胞来源有关，具有相对特异性，尤其在肿瘤细胞中，外泌体能表达肿瘤相关性蛋白质，例如结直肠癌和卵巢癌来源的外泌体含上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, ECAM），脑肿瘤来源的外泌体表达内皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR），从恶性胶质瘤患者血浆中分离得到的外泌体携带表皮生长因子受体Ⅲ型突变体mRNA[3-4]，并能作为恶性胶质瘤诊断标志物之一，应用于临床。

外泌体能被包括B细胞、T细胞、树突状细胞（dendritic cell, DC）、血小板、雪旺细胞、心肌细胞、上皮细胞、干细胞和肿瘤细胞在内的体内细胞释放。在低氧、辐射、氧化应激等刺激下，细胞膜内陷形成内吞小泡，转运至早期核内体，经过内部酸化等过程，早期核内体发育为晚期核内体，晚期核内体膜进一步内陷，形成直径约30～150 nm的多囊泡体，在转运必需内体复合物（endosomal sorting complex required for transport, ESCRT）参与下，MVB与细胞膜融合，将MVB内的囊泡释放到细胞外，释放到细胞外的囊泡即为外泌体[4-5]。

2 肿瘤来源的外泌体在白血病病理进程中的作用

白血病的发生发展是一个受到多因素多机制调节的长期而复杂的过程，其中，白血病细胞分泌的外泌体在这个过程中起着重要作用。

2.1 影响细胞增殖、凋亡和自噬

研究发现源自人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUCMSCs）的外泌体对细胞增殖具有刺激作用[6]。Shi等[7]发现在低氧条件下，高表达的miR-486通过靶向作用于Sirt1基因，促进红白血病TF-1细胞的生长和红细胞分化。Prieto等[8]发现在慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）中，白血病细胞所包含的S100-A9蛋白能增强NF-κB活性，促进CLL的进展。Raimondo等[9]研究发现，在慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia, CML）LAMA84细胞株内或皮下接种LAMA84-外泌体的小鼠体内，LAMA84-外泌体都能够通过自分泌机制激活抗凋亡途径，促进CML细胞的增殖和存活。外泌体中的凋亡抑制蛋白（如BCL-2、BCL-XL、MCL-1和BAX）能拮抗细胞凋亡并促进白血病细胞生长[10]。在对伊马替尼耐药的K562细胞中，达沙替尼可以抑制Akt/mTOR活性，并下调Beclin-1和Vps34依赖性自噬进而抑制外泌体释放，最终促进细胞凋亡[11]。Snigirevskaya等[12]通过细胞免疫组织化学分析发现，在人类白血病U-937细胞凋亡末期，外泌体的蛋白酶体被运输至U-937细胞中，参与细胞凋亡。

2.2 调节骨髓微环境

Corrado等[13-14]发现LAMA84细胞和CML患者血液释放含有双调蛋白的外泌体，并通过双调蛋白激活表面生长因子受体（EGFR）来调节骨髓微环境，为白血病细胞生长和存活提供了适宜的条件。实验还发现在HS5骨髓基质细胞和骨髓原代基质细胞中，加入的LAMA84-外泌体可以增加EGFR的磷酸化，并增加Snail基因调控的趋化因子白介素8（IL8）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，这说明外泌体可以参加EGFR信号转导途径。此外该研究显示，LAMA84-外泌体与HS5骨髓基质细胞共培养后膜联蛋白A2-mRNA表达增加，促进LAMA84细胞对HS5基底膜的黏附。CML细胞释放的外泌体刺激骨髓基质细胞产生趋化因子IL8、激活趋化因子受体1（CXCR1）和CXCR2下游的多个信号通路，促进恶性白血病基因表达。Feng等[15]用第六代miRCURYTM LNA阵列（v.16.0）进行了K562细胞和K562细胞衍生的外泌体-miRNA微阵列分析，观察到K562细胞-外泌体能选择性表达miRNA，通过基因本体论（Gene Ontology, GO）和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）分析，发现外泌体能增加CML细胞与骨髓微环境的黏附来促进CML的发展。Asano等[16]通过TaqMan低密度阵列分析发现在停用络氨酸激酶抑制剂后，出现肌肉骨骼疼痛的CML患者循环中的外泌体源的miR-140-3p升高，并追踪深层分析发现骨痛缓解的患者体内外源性miR-140-3p下降。研究发现miR-140-3p上调可能抑制了肌肉特异性跨膜蛋白Myomarker的表达，导致CML患者的肌肉骨骼疼痛。从而证实了外泌体源miR-140-3p在气道平滑肌细胞和靶向标记的肌肉特异性跨膜蛋白中具有炎性反应相关的生物学功能。Paggetti等[17]研究发现CLL的发病机制与肿瘤相关微环境和免疫系统功能障碍密切相关。在原代CLL细胞和小鼠白血病模型中，外泌体被内皮细胞和间充质干细胞积极吸收，并将外泌体源的蛋白质和miRNA转移到靶细胞中诱导炎性反应，其类似于癌相关成纤维细胞，能够促进白血病细胞生存。因此，外泌体诱导基质细胞向癌相关成纤维细胞转化，基质细胞又能促进炎性反应细胞因子的增殖、迁移和分泌，从而提供有利于CLL细胞生存的微环境，内皮细胞摄取外泌体可增加血管生成，从而促进CLL的发展。

2.3 促进血管生成

外泌体中的蛋白质和miRNA介导细胞间信号转导，促进血管生成，参与白血病进展。Fang等[18]发现急性早幼粒细胞白血病细胞产生了大量易被内皮细胞摄取的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）（包括外泌体），从而促进血管生成。CML细胞可通过外泌体源miR-21和miR-126穿梭进入内皮细胞，其中miR-21能直接靶向作用于RhoB/Rho GTP酶及RhoA，参与细胞生长调节、细胞信号转导和细胞骨架重组过程，从而影响内皮细胞的血管生成能力。外泌体源miR-126被人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）摄取，靶向作用于HUVECS中的CXCL12和VCAM3’-UTR mRNA，减弱LAM84细胞的运动及其对血管内皮的黏附[19]。Umezu等[20]将K562细胞源外泌体与HUVECs共培养，用TaqMan低密度芯片检测到外泌体源miR-92a过表达，作用于靶基因整合素α5，促进了内皮细胞迁移和血管形成。CML细胞产生的外泌体还能诱导细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1以及趋化因子IL8表达增加，引起内皮细胞运动性增强，促进血管生成。外泌体还能使内皮细胞表面的VE-钙黏蛋白和β-连环蛋白减少，破坏内皮完整性，刺激血管再生[21]。Mineo等[22]发现CML细胞株K562细胞释放的外泌体通过Src信号通路（Src磷酸化）促进血管生成。

2.4 抑制造血

Hornick等[23]发现急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia, AML）细胞产生的外泌体对造血干细胞/祖细胞（hematopoietic stem cell/progenitor cell, HSPC）有直接抑制作用。研究发现在AML细胞及携带AML移植瘤的裸鼠血浆中，分离提取的外泌体含有大量miR-150和miR-155。将血浆外泌体与HSPC共培养，发现外泌体源miR-150和miR-155能抑制参与HSPC分化和增殖的转录因子c-MYB编码的转录产物的翻译，抑制集落形成，从而抑制造血。Huan等[24]发现外泌体可作为肿瘤微环境的旁分泌调节剂。在AML小鼠模型中，外泌体通过下调基质细胞中的造血干细胞的关键维持因子SCF和CXCL12间接影响造血功能。研究还发现c-Kit+祖细胞中的转录因子c-Kit，c-Myb、Hoxa9、E2f3和Ship1与骨髓基质中的SCF和CXCL12表达均减少。因此，AML外泌体通过基质直接或间接抑制了造血功能。

2.5 介导免疫逃逸和抗白血病免疫

研究表明，肿瘤来源的外泌体对白血病细胞以及免疫细胞的调节作用具有双重性。一方面，肿瘤来源的外泌体通过特异性表达CD34、TGF-β1等信号分子下调NK细胞表面受体表达抑制白血病免疫，另一方面，还能通过将其所含抗原呈递给CTL，诱导抗白血病免疫。

Hong等[25]利用免疫磁珠技术分离AML细胞株Kasumi-1和健康志愿者血浆来源的外泌体发现，Kasumi-1外泌体特异性表达CD34，AML CD34+外泌体和非CD34+外泌体分别通过下调自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）表面受体NKG2D和NKp46表达，抑制免疫。进一步研究表明，表达TGF-β1的AML外泌体与NK细胞共培养后，NK细胞NKG2D表达下调，提示携带TGF-β1的外泌体能通过下调NK细胞表面NKG2D抑制肿瘤免疫[26]。然而，研究者通过TEM和Western blot分析急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）细胞株NB4来源的外泌体发现，NB4外泌体能表达视黄酸受体α（retinoic acid receptor α, RARα）、细胞黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）和HSP70；通过外泌体与DC共同诱导的细胞毒性T细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）比仅通过DC诱导的CTL对NB4细胞杀伤力更强，表明外泌体可能通过ICAM-1和Hsp70将抗原呈递给DC细胞，发挥抗白血病作用[27]。

3 外泌体与免疫治疗

外泌体具有组织特异性，不同来源的外泌体具有不同的生物活性，免疫细胞分泌的外泌体常能诱导细胞产生免疫应答，如活化的NK细胞分泌的EVs通过激活靶细胞的半胱天冬酶途径，对癌细胞产生细胞毒性，在肿瘤免疫中起重要作用[28]。TGF-β1低表达的外泌体靶向作用于DC，促进DC成熟，从而诱导有效的抗白血病免疫，该靶向作用将为白血病提供新的免疫治疗思路[29]。同时，外泌体可作为运载工具通过搭载mRNA、miRNA、非编码RNA、线粒体RNA以及相应的药物分子，起到免疫治疗的作用。Bellavia等[30]发现含有IL3-Lamp2B以及被伊马替尼修饰的外泌体，能够在皮下接种LAMA84细胞的NOD/SCCID小鼠中特异性靶向作用于肿瘤细胞，使肿瘤变小。目前许多研究表明，药物能通过作用于外泌体从而改变白血病的发生发展。Taverna等[19]发现在CML细胞中，具有抗癌作用的姜黄素可通过上调外泌体源的miRNA-21穿梭入内皮细胞及miRNA-21靶向作用于RhoB3s’-UTR mRNA来抑制血管新生。姜黄素也可通过减弱外泌体促血管生成作用和调节内皮屏障，从而减少血管生成。Mineo等[22]发现加入了达沙替尼的K562细胞，总外泌体的释放减少了，从而减弱了K562细胞的运动性。K562细胞产生的外泌体能够诱导达沙替尼敏感的Src磷酸化，进一步活化HUVECs中下游的Src通路蛋白，从而增加血管生成活性。近年来，随着外泌体相关研究的不断深入，针对外泌体的肿瘤靶向治疗的新方法可能为肿瘤患者带来新的选择。

4 肿瘤来源的外泌体作为生物标志物

由于不同亲本细胞源外泌体携载的信息分子不同，在生理和病理情况下，外泌体携载的信息分子也不同，在病理情况下，外泌体的分泌量增加，且外泌体理化性质稳定[31-32]，从体液中获取外泌体是非侵入性操作。因此，外泌体被认为是生物标志物的理想来源。在血液恶性肿瘤患者的血清中发现较大浓度的外泌体，它携带亲本细胞源的特异性膜蛋白，而在正常对照者的血清中很少检测到外泌体[33]。白血病源外泌体携带的信息分子随病程不同而变化，CML的自然病程分为3期：慢性期、加速期和急变期。根据CML源外泌体携带的miR-150、miR-155、miR-221和miR-1246的表达水平，能够有效地区分CML病程[34]。miR-150和CD19与CLL不良预后相关[35]；CLL源外泌体携载miR-155的表达量与患者对FCR化疗方案（氟达拉滨、环磷酰胺和利妥昔单抗）的疗效相关；miR-155低表达的患者对化疗能产生完全应答，而高表达的患者不能产生完全应答，提示预后较差。AML患者在化疗的不同阶段，AML源外泌体富载TGF-β1，3种TGF-β1形式（TGF-β1前导肽、非活性肽和成熟TGF-β1）的表达水平不同，其在病情好转后表达下调[26]。Wojtuszkiewicz等[10]报道，AML源外泌体富载的凋亡相关分子MCL-1、Bcl-2、Bax和Bck-X是辅助诊断、疗效观察、预后判断以及复发预测的有用指标[36-37]。另外，AML源外泌体携带的信息分子如miRNA可作为AML的微创早期生物标志物，从而发现微小残留病灶，及时调整治疗方案以及预防复发。但外泌体作为标志物在临床应用，尚需要探索简便、快捷的获取方法。

5 肿瘤来源的外泌体与白血病耐药

研究证实外泌体在实体瘤中可以参与肿瘤耐药的调节，而外泌体在白血病耐药中的作用研究相对较少。Crompot等[38]利用CLL细胞与分离出的EVs共培养，分别测定了细胞凋亡、活力、迁移和化学敏感度，结果发现骨髓基质细胞产生的EVs使CLL-B细胞自发凋亡或药物诱导的细胞凋亡减少、细胞耐药性增加、迁移能力增加以及基因表达增强，其中涉及B细胞受体途径的基因如CCL3/4、EGR1/2/3和MYC增加。细胞外泌体在CLL-B细胞/骨髓微环境的沟通中，起到了至关重要的作用。Fei等[39]通过将急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL）细胞与小鼠骨髓基质细胞共培养发现，小鼠骨髓基质细胞可将凝集素半乳糖结合蛋白-3（Galectin-3,Gal-3）包裹于外泌体中，并传递给B-ALL细胞，从而显著提高Gal-3水平。而Gal-3与细胞耐药密切相关，它可以保护B-ALL细胞逃避尼洛替尼和长春新碱的攻击，并通过Erk信号通路和NF-κB信号通路来诱导ALL细胞耐药。细胞耐药性的发生是复发难治性AML患者的主要死因。有学者发现，AML耐药株细胞可以以外泌体为载体，通过传递抗凋亡相关蛋白复合物参与基因调控，例如NPM1蛋白。而NPM1与AML的发生密切相关，NPM1的过表达可增加细胞抗凋亡能力[40]。另外，有多项研究表明，耐药是导致多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）复发的关键所在，Bandari等[41]报道当用BTZ、卡非佐米或美法仑作用于骨髓瘤细胞时，骨髓瘤细胞衍生的外泌体明显增多，其表达增加的乙酰肝素酶可降解细胞外基质，造成肿瘤细胞的增殖和转移以及血管生成，促进骨髓瘤的进展，最终导致患者复发。因此研究外泌体与白血病耐药的关系是临床研究的创新点之一。

6 展望

肿瘤来源的外泌体携带特异性的肿瘤细胞信息分子，是发现生物标志物、探索疾病进程及发病机制的重要窗口。在白血病进程中，白血病细胞分泌的外泌体可通过影响白血病细胞的增殖和凋亡、调节骨髓微环境、影响血管生成及直接或间接抑制造血等途径，促进白血病的发生和发展，还能作为白血病的生物标志物，检测白血病的发生和病情变化，目前相关研究仍相对较少，未来可进一步在不同白血病细胞株中研究外泌体是否具有相同的标志物特性。有研究报道外泌体参与白血病的耐药调控，但有关外泌体与白血病的耐药机制及靶向治疗方面的研究仍相对空白。未来，以外泌体及其miRNA为出发点的白血病耐药机制及靶向治疗研究，可作为新的前进方向。综上所述，在白血病诊断、治疗及监测病情发展过程中，外泌体是一个潜力巨大的媒介，但要使其在临床上发挥作用，还需要很多努力。