腹泻型肠易激综合征肝郁脾虚型病证结合大鼠模型的研究方法*

任培培，汪龙德，刘俊宏，赵 丽，吴亚娜，吴红莉，杨 博

(1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州730030; 2. 甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州730030； 3.兰州大学，甘肃 兰州 730030)

肠易激综合征 (irritable bowel syndrome，IBS)是一种功能性肠病,表现为反复发作的腹痛、排便异常或排便习惯改变。该病缺乏可解释症状和生化异常的形态学改变[1]，可不同程度地降低生活质量，临床上较难彻底治愈。根据患者的主要异常排便习惯,将IBS 分为4个主要的亚型[1],其中腹泻型肠易激综合征(IBS-D)最为常见，约占全部IBS患病人群的2/3[2]。中医药治疗此病有一定的优势，但缺乏明确的疗效机制，需要开展大量的动物实验。近年来,为了探索病证结合动物模型的研制, 许多医家进行了广泛的研究, 取得了较理想的成果, 然而仍存在诸多问题有待进一步解决。在此，笔者尝试总结建立IBS-D肝郁脾虚型动物模型的一般方法和评价体系。

1 疾病模型的建立方法

张北华[3]认为，目前IBS-D动物模型多在内脏高敏感动物模型的基础上叠加致泻因素来造模。常用的造模方法包括：①精神心理应激法。包括束缚应激、新生期母子分离应激、慢性不可预知应激、避水应激、游泳致疲劳应激、慢性激怒应激等。②病原体感染法。常用的病原体有旋毛虫、弯曲杆菌、志贺痢疾杆菌。③结肠化学刺激法。常用的化学物质有醋酸、芥子油、脱氧胆酸、丁酸盐、酵母聚糖。④结直肠扩张法。结直肠扩张是一种局部机械性刺激，此法是实验室和临床评估肠道感觉时使用最广泛的刺激方法[4]。⑤过敏刺激法。⑥除了以上模拟发病危险因素所用的造模方法以外，还有脑室内注射神经递质致敏、脑肠相互作用定向应激、腹腔注射前体致敏、腹腔注射抗生素导致细菌潜生体定植、基因敲除等，但这些方法并没有被广泛应用。

2 “证”模型的建立方法

中国古代医学中无“肠易激综合征”这一病名。根据IBS-D的主要临床症状可将其归属于“泄泻”“腹痛”等范畴。近年亦有学者将其归为“郁证”范畴[5]。刘康毅[6]从知网、维普、万方等数据库收集了近十五年与IBS-D相关的文献(1 189篇)，通过严格筛选从中提取IBS-D中医相关证候要素、证型等，发现肝郁脾虚是出现频次最高的证型。 肝郁脾虚证属于中医传统证候，造模方法也需以传统中医的病因病机理论为依据。肝郁脾虚多因情志失调、忧思恼怒而横逆乘脾,脾失健运,脾气渐虚。一般认为，肝郁脾虚时，机体存在神经-内分泌-免疫系统失调、脑肠轴异常、脑电生理功能紊乱[7]。这与IBS-D的西医学发病机制中脑-肠轴调节异常相吻合。

石亮[8]发现目前肝郁脾虚证的动物模型主要有3类：①药物造模法。通过大量药物如艾叶煎液、肾上腺素、CCl4等皮下大量注射造成急、慢性中毒性肝损伤。②情志刺激法。通过颈部带枷喂养法、捆绑法或夹尾激怒打斗法等改变动物的生理状态。③药物合情志刺激法结合。通过翻阅文献，笔者发现学者普遍认为药物造模法会一定程度上造成肝脏急、慢性的实质性损伤，但肝郁不能等同于肝损伤。综上可以认为，情志刺激造模法更加符合中医传统理论。

3 疾病模型特征与“证”模型特征的评价

3.1 IBS-D疾病模型特征的评价

从目前的动物模型来看，主要围绕病理生理特征进行研究。目前大多数学者认为IBS-D并非单因素导致,是多种因素共同作用的结果。内脏敏感性增高、胃肠动力学异常、脑-肠轴调节异常、精神心理障碍、肠道感染及免疫功能紊乱、肠道微生态失衡、饮食及遗传因素等与该病的发生过程密切相关[9]。已知其病理生理学基础主要是胃肠动力、内脏感知异常[1],那么IBS-D大鼠模型的建立可以以此作为评价标准并结合肠神经系统的神经递质观察。

3.1.1 内脏敏感性评价

张北华[3]总结出近年来国内内脏敏感性评价中最为常用的主要有以下几项：①腹部回缩反射。通过肉眼观察腹部的反应，可间接反应内脏运动的反射。②腹壁肌电活动。此是动物实验中衡量内脏敏感性最常应用的方法，指标客观，且操作相对简单。③神经元细胞的电生理。此是将微电级插入分离出的相应脊髓节段的单个神经元细胞，具有创伤性，对操作技术和设备的要求较高，因此一定程度上限制了该法的广泛运用。④离体肠管神经肌肉的收缩反应。

3.1.2 胃肠动力评价

采用胃排空小肠推进率测定法、胃肠道腔外电桥式应力传感器记录法、胃肠激素(胃泌素、胃动素、生长抑素等)测定、免疫组织化学方法、离体体胃肠平滑肌肌条动力测定、胃肠内压描记法[9]。

3.1.3 神经递质指标评价

黄辰等[10]从文献检索中得出用于评价IBS-D动物造模的常用指标有胃泌素、胃动素；赵梁等[11]通过观察发现生长抑素 和血管活性肠肽、 5-羟色胺等脑肠肽含量有明显变化。查阅文献发现,5-羟色胺、P物质、血管活性肠肽、生长抑素、一氧化氮等在肠易激综合征发病机制中的作用研究最多。由于目前还没有统一的组织学评价指标，尚将此作为IBS-D动物造模的评价指标。

3.1.4 腹泻的评价

国内外研究评价腹泻主要从大便的含水量、评分，腹泻的潜伏期，腹泻率，稀便率，稀便级，腹泻指数和体质量增长率几个方面进行[12]。

3.2 肝郁脾虚型特征的评价

3.2.1 肝郁评价方法

肝郁脾虚证患者除了腹痛、腹泻的症状外，还有急躁易怒或情志抑郁、善太息症状，多因情志因素诱发或加重。中医学认为肝郁多由情志不畅所致，日久犯脾而致脾虚。因此对中医肝郁证动物模型的评价多借鉴抑郁症的评价方法，常用的评价方法[3]有以下几个方面：①一般状态观察。通过大鼠皮毛变化、对外界刺激的反应、精神状态情况等来评价。②糖水偏好[10]。依据啮齿类动物喜嗜甜味溶液这一特点，用糖水作为奖赏，应激前后糖水偏好系数可作为评价大鼠快感缺失的重要方法，糖水偏好降低是抑郁大鼠的核心症状。③高架十字迷宫[10]。此是国际上公认评估焦虑行为的方法，利用大鼠对于新事物的好奇、高悬开放环境的恐惧和天生对黑暗环境的倾向。④旷场实验[10]。常以此用来评价肝郁脾虚动物造模期间的精神状态。⑤强迫游泳[10]。此是将大鼠被迫放在一个无法逃脱的游泳环境中，先出现游泳挣扎试图逃脱，后绝望转而放弃游泳。⑥悬尾实验[10]。将大鼠尾尖向上悬挂于固定装置上，大鼠为了摆脱这种不舒服体位出现挣扎，一段时间后主动放弃挣扎。

3.2.2 脾虚评价方法

脾虚证患者多表现为纳差食少，大便溏，体质量下降。通过观察各组大鼠体质量、大便和造模后进食量来评价其脾虚情况。

4 IBS-D大鼠模型肝郁脾虚的造模方法

4.1 乙酸灌肠刺激

李燕舞等[13]以乙酸每天1次、连续2周灌肠来建立 IBS-D 内脏高敏大鼠模型，并与母子分离(从出生后第2天开始母子分离，每天3 h)2周建立的模型做对照。以大鼠腹部回缩反射( AWR) 评估肠道敏感性来评价疾病；避水应激实验观察其排便数量对肠道运动进行评估腹泻症状的建立。结果：两种方法均可造成大鼠内脏高敏模型，但母子分离模型能更好地模拟IBS 腹痛及排便异常症状。遗憾的是该实验未对肝郁脾虚证型的建立进行评估。

4.2 母婴分离+乙酸刺激+束缚应激

柴玉娜等[14]按照文献方法采用母婴分离+乙酸刺激+束缚应激制备肝郁脾虚模型大鼠。造模结束后,用腹部回缩反射方法评估肠道敏感性;从进食量、糖水偏好率、自主活动情况进行行为学评分，以对肝郁脾虚证型的建立进行评估。该实验未对肠道动力及腹泻情况进行评估，此法能否建立稳定的IBS 疗效机制的动物模型，但仍需要进一步的研究。

4.3 醋酸灌肠+夹尾刺激法

刘启泉等[15]采用 1 mL 1%醋酸灌肠结合改良夹尾刺激 3周综合造模。每周 3 次，每次 30 min，期间同时对大鼠施行强光刺激、敲打鼠笼等以减少大鼠休息时间。造模过程中观察大鼠粪便情况，超过 25%的稀便、少于 25%质地坚硬粪便即为造模成功。通过观察大鼠皮毛变化、精神状态、稀便程度确立证型，观察大鼠粪便情况评价腹泻情况和肝郁脾虚的确立。镜下观察结肠组织，检验肠道变化建立疾病，通过造模前后IL-1β、P物质、5-羟色胺含量的变化评价疾病的建立。此法的评价指标简单，但能否再次复制仍需要进一步的研究。

4.4 饥饱失常+番泻叶灌胃+强迫游泳

郭红[16]在使用肠激宁方治疗肝郁脾虚证IBS-D的实验中采用饥饱失常+番泻叶灌胃+强迫游泳2周的方法造模，复制肝郁脾虚证IBS-D大鼠模型。以大鼠抬腹压力阈值、拱背压力阈值来评估大鼠结肠敏感度，以大鼠的大体情况、粪便含水量、稀便级数、稀便率评估腹泻症状的建立配合炭末推进率评估肠道动力，以两者确立疾病；以糖水偏好指数、旷场实验、大鼠体质量变化评估肝郁脾虚证型。此法采用多种实验评价方法验证，可靠性强，但文献中并无具体操作方法，实验复制难度大。

4.5 新生母子分离 + 慢性束缚 +番泻叶灌胃法

赵迎盼等[17]研究了IBS-D肝郁脾虚型病证症结合大鼠模型的建立。采用新生母子分离 2周+慢性束缚3 周+番泻叶灌胃1周法成功复制了该模型，并进行高、中、低剂量组实验，确定番泻叶灌胃 0. 45 g /m L、1 m L/100 g效果最佳。造模后以结直肠扩张的疼痛阈值代表内脏敏感性以评价疾病，以旷场实验和血清D-木糖水平评价肝郁脾虚证型的建立;以排便粒数和稀便率评价腹泻症状的建立。该研究认为此三因素复合 SD 模型大鼠符合 IBS-D 肝郁脾虚型疾病特点，可能是一种较好的研究中医药治疗 IBS 疗效机制的动物模型。

张北华等[18]通过对几种造模方法进行动物实验对比研究表明：采用母子分离 8 周+慢性束缚应激3周+番泻叶灌胃1周，番泻叶煎剂( 0. 45 g/mL)灌胃( 4. 5 g/kg) 可成功建立肝郁脾虚型病证结合大鼠模型；采用慢性束缚联合母子分离法造模优于单一因素法；内脏敏感性评价疾病、大便积分评价腹泻症状的建立、旷场行为学评价肝郁脾虚证型的建立。该研究所建立的肝郁脾虚型大鼠模型具有内脏高敏感性、肠道通透性增加、抑郁和免疫功能异常等多种特征。

周云等[19]以番泻叶水煎剂灌胃+四肢慢性束缚应激刺激每天1次、连续6 d的方法建立肝郁脾虚型IBS 大鼠模型，观察大鼠的一般情况如体质量、粪便含水量、稀便级数评价腹泻症状的建立及肝郁脾虚模型的建立，小肠炭末推进百分率评估肠道动力，血清中 5-羟色胺含量变化评价疾病的建立，大鼠模型结肠黏膜组织无明显病理改变符合功能性肠病的改变。此法建立的肝郁脾虚型大鼠模型评价指标简单，可重复性强，但未对肠道敏感性进行评价，是否能作为稳定的IBS 疗效机制的动物模型，仍需要进一步的研究。

5 讨 论

IBS-D肝郁脾虚型大鼠模型是一种具有肝郁和脾虚两种证候特点、以腹泻为主症的一种非器质性疾病模型。通过查阅文献，笔者发现由于精神心理因素在发病机制中具有重要作用。在实践中，心理应激(慢性束缚应激)联合夹尾刺激、番泻叶灌胃或乙酸灌肠是最常采用的造模方法，符合中医情志致病的理论：肝郁久犯脾，可导致脾虚。新生期母子分离作为情志刺激，也可导致肝郁。番泻叶一般被认为是苦寒泻下脾虚造模的首选，可致腹泻，是中医脾虚证的一个致病因素。因此,慢性束缚应激、夹尾刺激不仅可使大鼠内脏敏感性增高又是肝郁证造模的方法。本研究的目的即是寻找出一种最接近肝郁脾虚证本质的稳定的可重复的造模方法。

目前对 IBS-D 动物模型的造模方法尚未成熟，建立IBS-D 肝郁脾虚型病证结合动物模型的研究中依旧存在一些问题。值得一提的是，利用西医疾病模型与中医证候特点的单纯叠加，可以更好地模拟 IBS-D 的病理特点。现有的病证结合动物模型造模方法分析，多采用束缚应激法模拟疾病特征，这种方法作用短暂，模型稳定性欠佳；建立证候模型所用造模方法缺乏公认性和普适性。通过大量的研究,需要对上述问题进行验证和改进,使 IBS-D 肝郁脾虚证与动物模型结合起来更加成熟,充分发挥中医药的优势。没有明确的标准,就没有合格的模型产品，因此在实践中,应不断摸索和完善病证结合动物模型的统一的评价方法。根据肠易激综合征的发病机制,对动物模型的研究尚处于探索阶段，全面深入地研究其发病机制对该证型造模方法具有重要意义。同时,肝郁脾虚证动物模型有助于研究该证型复方的作用机理,验证复方的功效，进新药开发,充分发挥中医药治疗的优势。