自然老化对女性皮肤微生物组多样性的影响

人体最大的器官—皮肤，被各种微生物（包括真菌、细菌、古细菌和病毒）覆盖着，其中细菌占比最多。一些研究表明，皮肤微生物组的组成是由包括皮脂分泌和环境干湿情况在内的皮肤微生物群落生境来决定的。另外，年龄和性别等多种宿主因素也会影响健康个体的皮肤微生物组。皮肤微生物组是一个动态可变且复杂的生态系统，因此也被称为皮肤微生态。皮肤微生态平衡的维持对皮肤健康十分重要。

随年龄增长，受内源性（如细胞代谢、免疫活性、激素状态）和外源性（如紫外线、污染物、其他毒素）因素的共同作用，皮肤会发生老化，其结构和功能都会出现渐进性改变。例如，随年龄增长，汗液和皮脂的分泌会减少，免疫功能会降低，这些变化会导致皮肤表面生理指标出现显著变化，pH值、脂质组成和皮脂分泌都会受到影响。而上述这些生理变化可引起皮肤微生态的潜在改变，从而影响皮肤表面微生物组的信息。有研究者通过分析不同年龄段人群皮肤微生物组，展示了人类从婴儿期至青春期再到成人期皮肤微生物组的转变和过渡，以及人口起源和居住环境对成人皮肤微生物组的影响。但是，关于年龄（自然老化）对不同皮肤部位微生物组的影响研究还很少。

为排除性别影响，该研究仅针对女性志愿者展开。对年轻组和年长组日本女性的皮肤表面细菌多样性和组成特征进行了对比研究，样本采集于4处不同的皮肤部位，分别代表干燥（前臂屈侧）和油性（头皮、前额、面颊）皮肤区域，并利用高通量焦磷酸测序获得的16S rRNA 基因序列数据对细菌群落进行分析评估。

一、材料和方法

1.志愿者和样本收集：招募生活在日本东京郊区的37名健康女性志愿者，无吸烟史且无痤疮或特应性皮炎等皮肤疾病，年轻组18名（21 ～37岁，平均年龄27.3岁），年长组19名（60 ～76岁，平均年龄67.4岁）。要求志愿者在采样前2 d 使用专门提供的不含抗菌物的洗发水清洁头皮和头发，采样时不可使用任何洗发、护发或造型产品。采样前还要求使用指定产品卸妆1次和洁面2次。最后1次洁面后，志愿者保持沉默（避免飞沫影响面部菌群）并休息2 h。随后在22 ℃、60%湿度的室内，用无菌棉签分别对每个志愿者头皮、前额、面颊和前臂屈侧皮肤进行采样。

2.DNA 提取、PCR 扩增测序以及统计学分析具体内容请参考原文。

二、结果

1.样品采集和16S rRNA基因V1-V2区测序：分析所有志愿者4 个部位皮肤的148 份样本的菌群信息。使用454 GS FLX Titanium 平台对细菌的 16S rRNA 基因 V1-V2 区（16S）测序，经质量和大小筛选之后，共获得1 019 132个读数。148 份样本中，每个皮肤部位的总读数范围为2 601 ～25 904个，每个样本的平均读数为6 886个。

按照标识阈值≥96%对高质量的16S 读数进行聚类，所有样本共生成4 156个运算的分类单位（OTUs）。分析数据表明，这4 个部位皮肤的样本量足以计算和覆盖37 名志愿者中至少两人共有的OTUs。

2.年轻组与年长组皮肤微生物组α 多样性（同一样本中物种丰富度）的差异：首先，根据观察到的和Chao1 估算的OTUs 数量以及Shannon 指数，对4 个部位皮肤微生物组的α多样性进行分析。稀疏曲线示前臂屈侧皮肤微生物组α多样性最高，另外3处结果相似；其次是面颊和前额（两者α 多样性相近），头皮微生物组α多样性最低。为了进一步阐明每处皮肤微生物组的年龄特异性特征，还比较了年轻与年长组的α多样性。基于观察到的OTUs 值，年长组4个部位皮肤菌种的丰富度均明显高于年轻组，且年长组Chao1估算的OTUs和Shannon指数均高于年轻组。表明年长组4处微生物组α 多样性均高于同部位的年轻组。从3个指标来看，面颊和前额微生物组的α 多样性在两个年龄组间均出现了显著的统计学差异。

3.年轻组与年长组皮肤微生物组β 多样性（不同样本间物种多样性）的差异：使用UniFrac-主坐标分析和UniFrac距离分析对4个部位皮肤的微生物组整体结构的相似性和变异性进行比较。加权和未加权的UniFrac-PCoA均显示，结果根据皮肤部位而呈聚集倾向。通过置换多变量方差分析（PERMANOVA）对这些差异进行评估，结果显示差异显著。

UniFrac 分析发现，两组间4 个部位皮肤微生物组β 多样性差异显著。年轻组与年长组最高分离曲线出现在加权UniFrac 分析的前臂微生物组中，以及未加权UniFrac 分析的头皮微生物组中。表明前臂屈侧和头皮微生物组β多样性的改变与年龄有关，且菌种的丰度和组成变化分别有助于前臂和头皮微生物组与年龄相关的多样化。相较其他3个部位皮肤微生物组（0.9 ～1.6倍），菌种组成对头皮微生物组β多样性差异的贡献主要是由于在年长组中观察到的OTUs数量显著增加（约为年轻组的3.8 倍）。还发现由少量16S读数组成的次要菌种/OTUs 的数量在年长组的头皮微生物组呈特征性增加，而同组其他3 个部位皮肤微生物组未观察到显著增加。

4.不同年龄组皮肤微生物组的分类学差异：根据微生物16S rRNA基因数据库中的种系型对OTUs进行分类。门级分类显示，4个主要门类（厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门）在4 个部位皮肤微生物群落中占据主导地位。其中，放线菌门占比最多，其平均丰度在面颊、前臂、前额和头皮部位分别为61.8%、40.3%、67.6%和83.3%。而且，年长组面颊、前臂和前额微生物组中放线菌门的丰度明显低于年轻组，其他3 个门类的丰度则呈现为增加。年长组前臂放线菌门相对丰度的减少（约为0.6倍）最为显著，前臂和头皮变形菌门的丰度明显高于年轻组，前额厚壁菌门和拟杆菌门的丰度明显高于年轻组，面颊拟杆菌门的丰度明显高于年轻组。上述数据揭示了两个年龄组间4个部位皮肤微生物组整体分类学的差异。

属级分类显示6 个属（丙酸杆菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌属、链球菌属、不动杆菌属和普氏菌属）占比较大，平均丰度均≥1%。其中，丙酸杆菌属占绝大多数，在头皮、前额、面颊和前臂样本中总检出量分别约为78%、57%、52%和19%。两个年龄组6 个主要属的丰度对比显示，年长组面颊、前臂和前额微生物组中丙酸杆菌属的丰度明显低于年轻组。这与年长组这3种微生物菌群中放线菌门明显减少的结果是一致的（丙酸杆菌归属于放线菌门）。此外，年长组前臂微生物组中葡萄球菌属的丰度明显低于年轻组，面颊和前额棒状杆菌属则显著增加。不动杆菌属仅在前臂占优势，与年轻组相比，在年长组前臂和头皮微生物群中明显增加。年长组链球菌属和普氏菌属也较年轻组显示出较高的丰度，但结果不显著。

为了进一步确定两组间与年龄相关的皮肤微生物菌种信息，使用线性判别分析（LDA）效应值（LEfSe）方法，鉴定出38个菌种/OTUs LDA评分有显著性改变，其中31个菌种在年长组皮肤中过度表达，另外7 个（其中5 个为丙酸杆菌属）在年轻组皮肤中富集。至于皮肤部位，在面颊、前臂、前额和头皮中出现显著性改变的菌种分别为19 个、18 个、22个和13个。其中，15个菌种表现出皮肤部位特异性改变，在面颊、前臂、前额和头皮中分别为3个、5个、4个和3个。其他23个菌种在两个以上的不同部位皮肤发生改变，只有克雷伯菌和普氏菌在年长组的所有皮肤部位都发生了富集。为了确定这38个菌种的皮肤部位特异性，该研究还对口腔中检测到菌种的CORE数据库进行了相似性搜索。结果显示，30 个菌种的16S 序列与CORE 数据库中物种的相似性≥97%，其中16 个被认为是正常的口腔细菌，它们的不同CORE IDs序列≥3。这16个菌种归属于链球菌属、罗氏菌属、韦荣球菌属、普氏菌属、梭菌属和嗜血杆菌属，所有这些都是口腔细菌群落的核心成员，在年长组的4 个皮肤部位均有明显富集。

5.细菌多样性与临床皮肤参数的关系：为了解哪些皮肤问题与老化相关的皮肤微生态多样性有关，该研究还对一些细菌数据与志愿者实际年龄和皮肤临床参数（包括皮肤回声、厚度、毛孔面积、面颊色斑大小以及前额皮脂分泌水平和pH值等皮肤生理参数）进行相关性分析。在面颊部参数中，毛孔密度和皮肤弹性与志愿者年龄呈负相关，而色斑密度和真皮深层回声与志愿者年龄呈正相关且有统计学意义。前额皮脂分泌水平也与志愿者年龄呈负相关。另一方面，与年龄无显著相关性的色斑面积与Shannon指数呈正相关，与面颊丙酸杆菌属的丰度呈负相关，且具有统计学意义。

三、讨论

该研究显示，成年女性皮肤部位对皮肤微生物组的构成有重要影响。面颊与前额微生物组中菌种丰度和组成都有很高的相似性。前臂微生物组α多样性最高，头皮最低，与之前报道的干燥区域（如前臂）的细菌多样性高于皮脂分泌区域（如头皮、前额、面颊）的结果相似。

数据显示，年长组皮肤微生物组α 多样性/菌种丰度高于年轻组。该结论与一项中国研究相似，但有别于另一项研究，提示皮肤微生物组与年龄的相关性虽然取决于皮肤的部位，但生活方式、居住环境和性别差异也需要考虑。

在4 个皮肤部位微生物组β 多样性的年龄相关性差异中，前臂、头皮的差异比面颊、前额更为显著。两组间头皮微生物组的差异很大程度上源于菌种组成，表现为年长组头皮上次要菌种数量显著增加。另一方面，两组间前臂的差异很大程度上应归因于菌种的丰度，这可以通过年长组前臂微生物组中最主要种属丙酸杆菌属数量的明显减少来解释。因此证实，皮肤微生物组的年龄相关性变化与皮肤具体部位有关。

在4个部位皮肤中，年轻组与年长组OTUs/菌种数量差异最大的是头皮，但Shannon 指数的差异没有统计学意义。这可能是因为头皮微生物组中丙酸杆菌属的丰度极高（约80%）导致菌种的均匀度变化较小。

在前额、面颊和前臂，年长组皮肤微生物组多样性的增加与丙酸杆菌属相对丰度显著降低同时发生，这可能与老年人皮脂分泌减少有关。年长组前额平均皮脂分泌水平约为年轻组的一半，前额皮脂分泌水平与丙酸杆菌属的丰度呈正相关。与该结果一致，有研究报道，丙酸杆菌属会优先定植于富含皮脂衍生脂类的部位，且痤疮丙酸杆菌的密度与皮肤上的脂质总量呈正相关。因为该菌是重要的皮肤共生微生物之一，能够分泌抗菌物质、免疫调节物质和短链脂肪酸而使宿主受益，丙酸杆菌属的耗尽会削弱这些益处，从而促进临床/生理性皮肤老化的迹象。

LefSE 分析确定了38 个菌种，很大程度上帮助区分了两个年龄段皮肤微生物组，其中大部分在年长组样本中有明显的过度表达，包括在口腔中检测到的许多正常细菌。此结果表明，口腔细菌在很大程度上促进了年长组皮肤细菌的改变及多样性。因为在年长组皮肤检测到的口腔菌种相对丰度足够高，且有较高的部位特异性，因此可以排除口腔菌种短暂定植的可能性。尽管数据支持皮肤与口腔细菌间存在年龄依赖性的相互联系，但目前这些定植在皮肤上的口腔细菌的生物学作用基本上是未知的。另一方面，口腔细菌丰度高被认为是该研究中老化皮肤微生物组的一个特征。

总之，结果表明，年轻人皮肤的微群落生境对皮肤菌群定植的选择压力大于年长者皮肤，导致年轻人皮肤微生物组中个体变异性和菌种丰度都低于年长者皮肤。上述变化是由于年长者皮肤细胞更新减慢、汗液和皮脂腺功能下降，以及免疫系统功能减弱等。

皮肤参数与微生物组相关性分析显示，存在两种不同的相关性模式，即年龄相关模式和非年龄相关模式。通过几种皮肤参数如皮脂分泌水平、毛孔密度和与皮肤弹性随年龄的增长而降低，以及色斑密度和真皮深层回声随年龄的增长而增加这一现象，可以观察到与年龄和一些微生物组数据均有相关性。这些与年龄有关的相关性可以通过不同的年龄相关现象来说明一种间接的关联。相反，色斑面积代表了非年龄相关性参数，该参数与年龄无关，但与Shannon指数呈正相关，与丙酸杆菌属和普氏菌属的丰度呈负相关。众所周知，色斑面积会随着日照增加而增大，这表明其与皮肤的光老化有关，而不是与自然老化有关。因为光老化是由环境中的日光照射所导致，所以日照和非日照皮肤微生物组的进一步对比研究可以阐明环境和宿主对皮肤微生物组影响的差异。

综上所述，老化对日本女性皮肤微生物组多样化和多样性的变化具有重要影响。也可以认为，随年龄变化的皮肤微生物组多样化与皮肤生理变化有关。因此，皮肤微生物组可以作为一种新的指标来量化皮肤的年龄，无论其实际年龄如何。据报道菌群分类与功能多样性之间存在显著相关性，因此通过宏基因组学和代谢组学来阐明老年人皮肤特有的功能特征，对深入了解老化的皮肤和探讨预防皮肤问题（特别是老年人皮肤问题）的新方法可提供依据。