“食品微生物学实验”改革案例——传统发酵食品中乳酸菌的分离纯化及分子生物学鉴定综合性实验

吴海清 ，肖 萍 ，何新益 ，王 娜

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300384）

“食品微生物学实验”作为食品专业的基础实验课，其实用性、技术性、应用性极强[1]。对于食品科学类学生和食品领域的从业人员来说，食品微生物学实验是必备的实验技能[2]，课程内容一般分为验证性实验、综合性实验、设计性实验3种类型[3]，其中综合性实验是多个基础的验证性实验的连续开展，可提升学生实验的综合处理能力[4]。为了提高学生的综合实验技能，提高学生设计、分析及解决实验中出现问题的能力，课题组设计了“传统发酵食品中乳酸菌的分离、纯化及分子生物学鉴定”综合性实验的案例。通过2年的改革与实施，取得了良好的实验教学效果，为进一步深化教学改革具有重要的参考价值。

1 实验设计理念

参考国家标准，在“食品微生物学实验”细菌学分离鉴定这部分实验环节，课题小组设立了“传统发酵食品中乳酸菌的分离、纯化及分子生物学鉴定综合性实验”，此实验包含材料采集、培养基的配置与灭菌、微生物的纯种分离和培养、光学显微镜的操作和纯培养菌种的形态观察、微生物的染色、微生物的种类鉴定、菌种的保藏等环节。该实验具有很强的科研属性，学生不仅要参与实验的准备，而且更需要用科研的思维来完成实验任务，包括深入理解实验的目的和意义、查阅国内外相关文献资料、设计实验方案、确定实验方法和步骤、准备实验材料、学习仪器的使用方法、配制实验所需试剂、撰写预习报告和实验报告等。通过这一系列实验环节，训练学生从混杂的环境中分离、鉴定出单一菌株，并学会保藏菌种，锻炼学生用理论知识指导实践的能力，融合基础实验所学的操作技术，综合运用到实验项目中，进一步锻炼学生的团队协作能力。为今后的大学生创新训练和毕业论文等教学实践环节打下了坚实的基础[5-6]。

2 实验目的和要求

了解乳酸菌的菌体形态和菌落特征形态，学习乳酸菌的分离原理，掌握乳酸菌的分离方法与操作技术，PCR扩增基因的基本方法，掌握细菌传统鉴定及16SrRNA分子鉴定的方法，并能熟练操作该项技术。该实验共9学时，每小组6～7人。

3 实验内容和方法

（1）样品。未成熟的酱醪、泡菜或酸乳等。

（2）实验设备。鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、PCR仪、显微镜，电泳槽，电泳仪，PCR扩增仪，高速冷冻离心机，凝胶成像仪、超净工作台、恒温培养箱等。

（3） 试剂。溴甲酚绿（BCG） 牛乳营养琼脂培养基、MRS肉汤培养基、M17肉汤培养基；基因组DNA提取试剂盒、2×Mixture、琼脂糖、50×TAE、通用引物（27F和1492R）、革兰氏染色试剂盒等；Gelred核酸染料、DNA Ladder（核酸Marker） 等。

（4）实验原理。采用分离鉴定培养基将检样中乳酸菌分离出来，得到纯菌株，再进行16SrRNA序列进行分子生物学鉴定。

（5）实验操作步骤。①培养基的配制：溴甲酚绿（BCG）牛乳营养琼脂培养基、MRS肉汤培养基、M17肉汤培养基分别灭菌，无菌检查合格后备用。②乳酸菌的分离：按照国标的方法进行无菌操作，接种于BCG培养基，于37℃下培养24～48 h，挑取典型菌落进行革兰氏染色，镜检。③乳酸菌的纯化：将革兰氏染色为阳性的乳杆菌分别接种于MRS、M17琼脂培养基中连续传代3次，镜检、菌落特征进行纯种鉴别。④乳酸菌的分子生物学鉴定：模板DNA提取、16SrRNA基因扩增、PCR反应产物检测均由学生独立完成，PCR产物纯化及测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。将测得的16S rDNA序列输入NCBI数据库，进行BLAST同源性比对，构建系统发育树。⑤实验结果：分离出的乳酸菌菌落形态图并加以描述，建立典型乳酸菌的16S rDNA系统发育树，乳酸菌的RAPD分型电泳图。

4 实验考核方法

以前的微生物学实验考核更多的是注重实验报告上的实验结果，往往忽略了整个实验操作过程。这种做法致使部分学生产生惰性心理，依赖同组的其他人，甚至会出现抄袭实验结果的现象。对实验考核标准进行了完善和改革，考核内容涵盖了从实验方案设计、实验方案实施、平时表现、实验报告到实验考试整个过程。实验成绩主要由实验方案设计（10%）、方案实施（20%）、平时表现（20%）、解决问题的创新能力（10%）、实验报告（20%）、实验考试（20%）6个部分组成。

5 存在的问题

因为综合性实验比传统的实验要复杂得多，不少学生曾流露出畏难情绪。为此，在实验过程中指导教师花费了大量心血，帮助学生顺利完成从文献查阅、实验方案制定到实验技能培养、实验结果总结和实验论文撰写的各个实验教学环节。以前的食品微生物学实验一般安排为每位学生每周完成1次独立实验，实验室每周仅开放1次，极大地限制了学生实验的自主性。教学内容改革后，要求学生应根据本组实验的进程和需要，随时进入实验室完成实验。指导教师除了每周进行集中讲解和指导外，每天还抽出一定时间在实验室进行针对性的指导和答疑。

6 学生对实验的评价与反馈

根据实验设计和要求，研究在2016和2017级食品科学与工程专业2个班级学生中进行了实验和评价，达到了较好的效果，获得了很多宝贵的经验。学生在实验报告总结中写到：“通过此次实验，对食品微生物学实验产生了浓厚的兴趣，巩固了微生物实验操作技能。”“通过实验课的学习，加深了对微生物学理论知识的理解，并且经过综合性大实验的训练，学会了怎样设计研究课题，熟悉了各个研究环节，学会了如何开展研究，为今后的毕业课题和走向工作岗位打下了坚实的基础。”学生一致反映自己的食品微生物学实验操作能力得到了有效的锻炼，食品微生物学知识得到了进一步升华，指导教师对实验结果也非常满意，获得了学院领导和教师的认可与好评。

7 结语

该综合性大实验，采用了以学生为主导、学生为中心的互动实验教学模式[7]，激发了学生的好奇心和学习兴趣，极大地提高了学生的参与度，明显提高了学生的综合素质和实验教学的质量，提升了教学团队的整体实力，使得学生不仅能够掌握实验的基础知识、仪器操作方法，更重要的是在实践中形成分析问题、解决问题的习惯性思维能力。今后如何适应社会发展的需求，培养高素质创新型人才，仍需要不断的思考、实践和探索。