肠道病毒71型感染诱导宿主细胞凋亡的研究进展

邱丽红，罗文英

肠道病毒71型感染诱导宿主细胞凋亡的研究进展

邱丽红，罗文英

524001 湛江，广东医科大学附属医院检验科

肠道病毒 71（enterovirus 71，EV71）是一种具有潜在致命性和破坏性的嗜神经细胞病毒，可能是新型小儿麻痹症的致病因素，局灶性瘫痪与受累的脑干灰质或脊髓有关[1]。EV71 感染引起的手足口病、疱疹和相关并发症的严重儿科病例和较高死亡病例在亚洲带来了巨大的公共卫生影响[2]。目前，EV71 疫苗已被批准用于手足口病预防，但仍面临各种 EV71 大流行毒株的适用性、疫苗生产和质量控制的国际要求、不同病原体监测和检测方法的标准化等问题[3]。然而，由于基因组突变率高，对 EV71 感染引起严重的脑和肺并发症甚至死亡的潜在机制尚不清楚，目前尚无针对手足口病患者的特异性抗病毒治疗方法。因此，EV71 感染的发病机制受到了医学和生物学领域广泛的重视。细胞程序性死亡通常是在病毒感染期间由宿主免疫反应引起的，通过干扰病毒繁殖的环境，从而限制病毒的传播[4]。细胞凋亡可以由细胞外源性途径（由死亡受体介导）和细胞内源性途径（线粒体）引发，这两种途径最终导致效应子半胱天冬酶（caspase）3、6 和 7的活化，也可以由细胞毒性 T 淋巴细胞和天然杀伤细胞引发递送颗粒酶类激活凋亡的 caspase[5]。近年来，研究发现细胞凋亡在 EV71 感染宿主细胞导致手足口病及并发症中发挥重要作用，为阐明 EV71 的发病机制提供新的理论依据。本文主要从 EV71 感染诱导细胞凋亡的信号通路方面讨论手足口病的致病机制。

1 细胞凋亡在 EV71 感染中的作用

细胞凋亡是发生在多种病毒感染、细菌感染、寄生虫感染和多种人类神经退行性疾病过程中的一个普遍而广泛的细胞生物学过程，可通过内源性或外源性途径发生，对病毒感染宿主具有预防病毒进一步传播、潜在抑制和解决炎症过程等优点[6]。细胞凋亡通过促进移除不需要的、受损的或感染的细胞从而在保持体内平衡、发育和人类疾病中起重要作用，然而也可能通过促成细胞死亡和组织损伤而具有致病作用。细胞凋亡发生在广泛的人类病毒感染中，包括感染中枢神经系统、心脏和肝脏[7]。病毒通过与宿主共存已经进化到能够利用它们入侵细胞的基本功能，如内吞、分泌、细胞分裂和凋亡，利用多种机制逃避或破坏细胞凋亡，包括凋亡传感器失活、凋亡调节因子的分子模拟和 caspase 裂解的扰动，可以通过干扰凋亡识别和清除机制来达到自己的目的[8]。通过清除有害细胞，抑制免疫反应，保证发育过程中正常组织和器官的形成，凋亡细胞的清除在所有多细胞生物中都起着重要的作用。在 EV71 感染细胞诱导新的 RNA 颗粒的形成过程中，抗病毒 RNA 颗粒的经典应激颗粒形成受抑制，其可促进细胞凋亡并抑制 EV71 的传播[9]。细胞凋亡的严重程度不仅与病毒滴度的升高有关，而且凋亡通常发生在病毒感染的解剖部位，动物模型也揭示了细胞凋亡与疾病严重程度的正相关关系，提示细胞凋亡是病毒诱导疾病的发病机制[7]。

许多病毒都有细胞凋亡抑制基因，一旦在感染细胞内表达就可以在病毒繁殖期避免诱导细胞凋亡，另一方面病毒可以利用刺激细胞凋亡来促进脱落和传播，防止感染细胞向免疫系统提供病毒抗原和杀死未感染的限制病毒传播的免疫细胞[10]。感染宿主细胞是否经历凋亡取决于病毒类型、致病性和抵抗感染细胞的抗病毒反应或逃避免疫细胞的任何攻击的能力。因此，病毒基因组在整个进化过程中得到了适应，满足特定病毒在其生命周期中诱导或抑制细胞凋亡的需要。

2 EV71 感染诱导细胞凋亡的信号通路

2.1 外源性途径

外源性细胞凋亡是由细胞外微环境扰动引发的调节细胞死亡的模式，主要由两种类型驱动质膜受体：①死亡受体，其中激活取决于同源配体的结合，包括 Fas 细胞表面死亡受体和 TNF 受体超家族成员；②依赖性受体，其活化发生在其特定配体的水平降至特定的水平以下时。依赖受体家族包括大约 20 名成员，包括轴突生长诱导因子、神经营养素受体神经营养因子受体酪氨酸激酶 3 和音猬受体修补 1[11]。病毒感染可引发外源性死亡受体介导的细胞凋亡，在病毒发病机制和宿主抗病毒反应起着重要作用，通过协助持续的病毒感染或者引起宿主消除受感染的细胞，病毒编码的基因产物，抑制死亡受体介导的细胞凋亡和逃避宿主免疫反应[12]。EV71 感染人横纹肌肉瘤细胞（human rhabdomyosarcoma cells，RD）显著增强 FasL 和 caspase-3 的表达，进一步激活Fas/FasL 介导的凋亡途径，而黄芩苷处理后的 EV71 感染的 RD 细胞中 FasL 的表达受到抑制，说明黄芩苷可有效抑制 EV71 感染的 RD 细胞的凋亡[13]。EV71 病毒 2C 蛋白阻止 TNF-α 诱导的 NF-κB 激活，揭示了 EV71 抑制抗病毒免疫应答的一种潜在机制[14]。HT-29 细胞在 EV71 感染中发生凋亡，但 ERK1/2 和 JNK1/2 信号的激活似乎抑制了 TNF-α 和 FasL 的诱导，并抑制了感染细胞的外源性细胞凋亡[15]。目前的数据表明，在 EV71 诱导的手足口病的发展过程中，TLR3 和 Notch 信号的相互作用调节 CD14 单核细胞功能和炎症反应[16]。EV71 感染的细胞中 NEDD4L 和 PSMF1 的水平分别增加和降低，NEDD4L 的消耗显著降低了 EV71 的复制，而PSMF1 敲低增强了 EV71 的复制，提示宿主蛋白 NEDD4L在该病毒复制中的新作用[17]。

2.2 内源性途径

内源性细胞凋亡途径由广泛的细胞内应激条件引发，包括细胞因子剥夺、DNA 损伤、氧化应激、细胞溶质 Ca2+超载和内质网应激，这些异常的凋亡信号通过触发线粒体外膜透化，促进细胞色素C（cytochrome C，Cyt C）和其他线粒体因子释放到细胞质中，最终导致激发剂和效应 caspase 的产生以及随后的细胞死亡[12]。B 细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的成员是线粒体介导细胞凋亡的关键仲裁者。Bcl-2 失调介导的细胞凋亡是许多疾病的基础，许多病毒 Bcl-2 的同源物可以破坏宿主细胞的凋亡和自噬，防止被感染的细胞过早死亡[18]。无论是感染 EV71 还是表达 EV71 2B 蛋白的细胞，其凋亡在 Bax 敲除细胞中均显著减少，而在 Bak 敲除细胞中则没有出现显著减少，重组 Bax 处理后从表达 2B 的细胞中分离出的线粒体显示 Bax 相互作用增强，Cyt C 释放增加，抗凋亡蛋白 Bcl-X 的过表达消除了 2B 诱导的 Cyt C 释放和caspase 活化，表明 EV71 2B 蛋白通过直接调节促凋亡蛋白 Bax 的重新分布和活化来诱导细胞凋亡并影响线粒体凋亡途径，揭示了在 EV71 感染期间 Cyt C 释放和线粒体通透性机制的重要线索[19]。EV71 通过非结构病毒蛋白 3C 激活 caspase-3 诱导宿主细胞凋亡，3C蛋白结合 caspase-8 和 caspase-9，但并不直接结合 caspase-3，抑制 caspase-3 活性可减弱细胞凋亡和降低 EV71 病毒蛋白的表达和病毒产量，但对病毒进入、复制甚至多蛋白翻译无明显影响[20]。在 EV71 感染期间经常诱导细胞凋亡以抑制病毒复制，同时利用抗细胞凋亡途径如 PI3K/Akt 途径来完成病毒生命周期，在 EV71 感染期间通过磷酸化和灭活 ASK1 来激活 PI3K/Akt 途径限制 JNK 介导的细胞凋亡[21]。在 EV71 感染期间，凋亡诱导因子（AIF）被截断并从线粒体转移至细胞核，伴随着 Cyt C 的释放，线粒体膜电位急剧下降，AIF 敲除对凋亡细胞的死亡具有显著的保护作用，添加泛 caspase 抑制剂可以提供更大的保护作用[22]。

2.3 细胞内质网应激介导的凋亡通路

内质网是一系列细胞功能发生的一种真核细胞器，包括运输细胞材料、提供增加的表面细胞反应区域和蛋白质、类固醇和脂质的产生，同时内质网应激是表示各种刺激影响内质网功能途径的总称，内质网应激诱导一种进化上保守的信号传导途径，即未折叠蛋白反应，其目的是削弱刺激，并根据细胞对应激的适应情况决定细胞存活还是凋亡[23]。EV71 感染 RD 细胞引起内质网内伴侣蛋白、BiP 和钙网蛋白的过度表达以及 eIF2α 的磷酸化，但紫外线灭活病毒的感染没有观察到相似现象，表明内质网应激是由病毒复制而非病毒附着或进入导致[24]。EV71 感染可以诱导同型半胱氨酸诱导的 ER 蛋白（HERP），它是应激反应的调节剂并依赖于 MAVS 的参与，证明 EV71 诱导的 HERP 通过促进 I 型 IFN（IFN-α 和 IFN-b）和 III 型表达刺激宿主先天免疫以抑制病毒复制，HERP 通过与 TANK 结合激酶 1 的相互作用扩增 MAVS 信号传导并促进 IFN 调节因子 3、NF-κB 的磷酸化和核转位，可增强 IFNs 的表达，抑制 RNA 病毒的广泛复制[25]。GRP78/BiP 是一种 ER 伴侣蛋白，具有维持 ER 稳态的重要功能，过表达可减轻 ER 应激，EV71 感染可诱导 GRP78/BiP 上调，而 ER 中 GRP78/BiP 过表达下调病毒复制和病毒颗粒形成[26]。EV71 感染上调转录因子 X-盒结合蛋白 1（XBP1）mRNA 水平，但未激活剪接的XBP1smRNA 或其下游靶基因，EDEM 和伴侣蛋白、病毒蛋白在敲除 XBP1 后表达增加。EV71 病毒蛋白的合成和 EV71 产生的病毒颗粒在过表达 XBP1 的 RD 细胞中受到抑制，而肌醇需求酶 1 通过激活内质网下游 XBP1，在内质网应激反应中发挥重要作用[27]。

2.4 穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路

细胞毒淋巴细胞包括细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK），激活并识别目标介导靶细胞死亡的保守途径，细胞分泌毒颗粒至免疫突触并释放大量致命的蛋白质，包括穿孔蛋白、颗粒酶和颗粒溶蛋白[28]。缺乏 CD4+T 细胞的小鼠作为野生型小鼠对 EV71 感染具有抗性，而缺乏 B 细胞的小鼠对病毒感染高度敏感，其他免疫细胞对CD4+T 细胞功能的补偿不太可能，因为耗尽 CD4+T 细胞的野生型小鼠也对病毒感染具有抗性[29]。细胞毒性 CD8+T 淋巴细胞有效控制急性病毒感染，但在慢性感染发展时可能会耗尽，病毒特异性 CD8+T 细胞在 PD-1/PD-L1 途径的控制下同时产生多个颗粒酶，可以更好地了解急性病毒感染期间抗病毒细胞毒性免疫的发展[30]。NK 细胞是具有免疫监视的先天性淋巴细胞，在没有致敏的情况下识别和消除转化细胞、病毒、细菌和原生动物病原体感染的细胞。NK 细胞分泌多种细胞因子，包括 IFN-γ、TNF-α/β、CD95/FasL 和 TRAIL，以及含有穿孔素、颗粒溶素和颗粒酶 A 和 B 的细胞质细胞毒性颗粒[31]。自然杀伤 T（iNKT）细胞的缺乏以及免疫系统的不成熟与新生小鼠对 EV71 感染的易感性有关，在适应性免疫系统完全成熟之前，iNKT 细胞是保护年轻小鼠免受EV71 感染的重要抗病毒效应细胞。有研究证实 EV71 感染通过 TLR3 的信号传导活化 iNKT 细胞[32]。EV71 感染肺水肿（pulmonary Edema，PE）患者具有较低的循环 CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和自然杀伤细胞，IL-10、IL-13 和干扰素 IFN-γ 水平显著升高，广泛的外周和中枢神经系统炎症反应可能是 PE 的发病原因[33]。

3 抗细胞凋亡药物的研究

槲皮素可有效预防 EV71 诱导的细胞损伤，对宿主细胞毒性低，可能以多种方式阻止病毒感染，抑制 EV713C 蛋白活性从而阻断 EV71 复制，对 EV71 具有一定的预防和强效治疗作用[34]。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯是一种抗氧化剂，通过调节泛素-蛋白酶体系统来抑制柯萨奇病毒 B 的复制，对 EV71 感染早期诱导的细胞凋亡也有显著的抑制作用[35]。茵陈主要通过抑制病毒内化而具有抗 EV71 活性，对病毒附着、VP2 翻译和病毒诱导的细胞凋亡的抑制作用最小，与其他药物联合治疗 EV71 感染会更好[36]。酸性多糖通过抑制细胞凋亡和诱导 IFN-β 表达，发现 LJ04 多糖具有强大的抗病毒活性[37]。GLSDY 抑制病毒 RNA 复制、形成病毒结构蛋白和非结构蛋白，可能通过直接抑制caspase-8 和间接抑制 Bax 来抑制病毒诱导的细胞凋亡[38]。在 EV71 感染 Vero 细胞中，姜黄素显著抑制病毒 RNA 的合成、病毒蛋白的表达和病毒后代的总体产生，减少了病毒感染引起的活性氧的产生，通过泛素-蛋白酶体系统抑制蛋白质降解，激活细胞外信号调节激酶，在病毒感染的早期阶段显示出抗凋亡活性[39]。芹菜素可通过抑制病毒 IRES 活性和调节细胞 JNK 途径来抑制 EV71 复制，阻止 EV71 诱导的细胞凋亡、细胞内活性氧的产生和细胞因子的上调[40]。

4 结语

EV71 是手足口病的主要病原体之一，常引起严重神经系统并发症，死亡率较高。由于 EV71 与宿主细胞相互作用的具体致病机制尚未清楚，目前没有针对性的药物和预防措施。研究发现 EV71 感染可以通过多条信号通路诱导细胞凋亡，主要包括内源性和外源性途径，但是还未详细阐明信号通路中相关分子的相互作用机制。研究抗细胞凋亡的药物主要是体外细胞实验，缺少体内及动物实验进一步的验证。通过激活或抑制细胞凋亡来控制凋亡程度，从而控制 EV71 感染的发生发展，对预防和治疗重症手足口病具有重要意义。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.013

国家自然科学基金（81301478）；广东省医学科学技术研究基金（B2017055）

罗文英，Email：luo_wenying@126.com

2019-04-22