DNA甲基化与高原低氧适应及适应不全※

杨 敏综述，冀林华审校

(1.青海大学高原医学研究中心，西宁 810001；2.青海省高原医学应用基础重点实验室，西宁 810001；3.青海大学附属医院血液科，西宁 810001)

DNA甲基化、组蛋白的化学修饰及染色质重构是表观遗传学最主要的三种机制。迄今为止研究最深最广的表观遗传学机制为DNA甲基化，即胞嘧啶上的C5原子在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化作用下添加一个甲基基团，生成5-甲基胞嘧啶，它通常发生在位于基因启动子区中胞嘧啶与鸟嘌呤高度聚集所形成的CpG序列，也称CpG岛。通常来讲，DNA高甲基化可通过改变染色质的结构来抑制基因的表达，相反，低甲基化则在一定程度上促进基因的表达[1]。

低氧可以影响人体的功能及能量代谢过程，并使之发生一系列生理甚至病理变化。但高原世居者通过漫长的自然选择过程，机体已经发生了一系列特异的适应于高原低氧环境的生理改变，具备相应的遗传学特性。目前已明确地证实了世界四大高原世居者具有明显区别于平原人的独特生理适应能力。同时，也有部分高原世居者或移居高原者在长期暴露于高原低氧环境后机体出现了一系列病理改变，也称为“高原适应不全”。过去的十余年，对于高原低氧的适应及适应不全的研究重点主要集中于以DNA序列改变为基础的基因多态性等遗传学机制上[2]。目前发现表观遗传学参与人类对高原低氧适应及适应不全的过程，它是衔接环境与基因组改变的核心。本文将对DNA甲基化与高原低氧的生理适应及适应不全的相关实验证据及机制分别进行综述。

1 DNA甲基化与高海拔慢性低氧适应

喜马拉雅山的藏族是全球高原居住历史最长的民族，其在青藏高原居住了大约3～5万年[3]。显然这些高原世居者已经具有了遗传学适应能力，人们对高原低氧适应的遗传学机理从深度及广度方面做了进一步研究并取得了大量的成果，提出这种独特的耐缺氧生理特征与正选择的遗传机制相关[4，5]。然而，高原世居人群最终体现出的适应表型并非仅仅由遗传变异单独决定，而环境与基因组可能共同决定着生物体最终的表现型[6]。表观遗传学可能代表了一种整合遗传和环境刺激并将其转化为表型结果的机制，它对协调机体适应环境的相关转录反应至关重要。DNA甲基化可能通过改变缺氧条件下基因转录过程从而参与形成人类高海拔适应模式。

当机体暴露于高原慢性缺氧环境，则启动各种代偿反应，如增加红细胞的数量以提高血液含氧量，增加新血管生成以加强含氧血液向组织的输送，改变细胞代谢的方式以减少氧气消耗，最终维持氧稳态[7]。低氧诱导因子(HIFs)是依赖于氧含量的转录激活因子，在低氧反应中参与调控氧稳态的基因转录。有研究者对高原藏猪和平原约克夏猪的心脏组织进行全基因组DNA甲基化测序，发现甲基化差异基因主要集中在HIF信号通路和参与肿瘤发生过程的通路中[8]。Xiong等[9]对藏牦牛和平原牛的HIF-1α和HIF-2α基因启动子区甲基化状态进行了分析，发现藏牦牛肾脏组织中HIF-1α和HIF-2α启动子区甲基化程度明显低于平原牛，且HIF-1α、HIF-2α mRNA的表达均高于平原牛，提出藏牦牛该位点的低甲基化状态可能是其对高海拔低氧环境的适应调控机制之一。

HIF可与低氧反应元件(HRE)上的位点结合，诱导下游靶基因的转录及表达[10]。这些靶基因的表达能够促进红细胞、毛细血管的生成，加速糖酵解。最新研究表明表观遗传学与HIF协同参与低氧转录反应[11]。研究发现大量的CpG二核苷酸存在于HRE序列中与HIF-1结合位点处，若该位点发生甲基化改变，则会抑制DNA与各类转录因子的结合，这表明HIF与核心HRE的结合位点可被5-甲基胞嘧啶阻断，同时也提示HIF-1依赖的HRE相关的基因调控对甲基化反应具有敏感性[12]。促红细胞生成素(EPO)基因被普遍认为是HIF介导的低氧转录反应中最具代表性的下游靶基因之一，EPO刺激红细胞生成的机制一方面为促进红系祖细胞增殖及分化，另一方面为抑制其凋亡[13]。适量红细胞生成可有效增加外周血含氧量，有利人类对于低氧的适应。EPO基因启动子区密集地分布着CpG二核苷酸，这些位点一旦发生甲基化，既能阻碍HIF与该位点的结合过程，又激活报告基因，而且发现EPO表达水平与该基因启动子区CpG甲基化程度呈负相关[14]。

HIF-2由EPAS1基因编码而成，它也是调控低氧转录反应的重要因子。Lachance等[15]研究发现EPAS1基因启动子区富含的CpG二核苷酸，可被DNMT3a催化诱导而发生甲基化，导致HIF-2 mRNA及下游靶分子表达减少。Childebayeva等[16]为了验证表观遗传学是否参与安第斯高原世居人群对高原低氧的适应，对来自高海拔(4388米)和低海拔(0米)的572例克丘亚人的EPAS1基因启动子区进行了甲基化分析，发现居住于海拔4 388米人群的EPAS1基因启动子区甲基化水平明显低于平原人，且移居高原者在高原的居住年限与EPAS1甲基化水平呈负相关，并指出无论短期或终身暴露于高海拔缺氧环境中都会对安第斯人的EPAS1甲基化产生影响，最后提出表观遗传修饰可能在高海拔适应的过程中发挥重要作用。

COX1是合成各类前列腺素的主要催化酶之一，慢性低氧情况下，COX1表达量将逐渐下降[17]。Zhen等[18]指出COX1基因与EPAS1、EGLN1等基因在对高海拔低氧适应性上具有趋同性。张峄桥[19]对高原和平原同种族人外周血基因组进行高原适应相关性甲基化片段的筛选，发现编码COX1和NADH脱氢酶的基因序列为两组的差异甲基化片段，适应于长期低氧的高原人群线粒体COX1位点存在甲基化并抑制基因的表达，因此由COX1介导的炎症反应程度降低，这种降低可能与高原低氧适应有关。NADH脱氢酶通常存在于线粒体内膜上，它在细胞氧化磷酸化反应中发挥着重要作用，该基因位点在高原人与平原人中存在甲基化差异，提示这种提高氧利用率以代偿低氧的生理作用可能是高原人对慢性低氧的适应性机制。

这些在慢性低氧环境中的转录反应，是维持机体组织代谢和功能的必要条件，而这些转录反应大多受到DNA甲基化的调控[11，12]。因此，DNA甲基化改变可能在高原低氧适应过程中发挥重要作用。此外，具有遗传性是DNA甲基化作为高原低氧适应机制的基本条件，现已明确地验证了由环境改变而诱导的DNA甲基化可以通过生殖细胞及体细胞等不同途径遗传给子代[20，21]。综上所述，DNA甲基化通过影响低氧条件下基因转录反应参与人类对高原慢性低氧的适应过程。

2 DNA甲基化与高海拔慢性低氧适应不全

在长期低氧环境中，高原世居者或移居高原者的机体通过各种调节机制以代偿机体缺氧，然而仍有一部分人难以适应高原低氧环境，因而出现一系列代谢紊乱、功能失调甚至病理结构的改变，统称“高原适应不全”(maladaptation to high altitude)。高原适应不全在不同的人中表现各异，如红细胞过度增生、肺水肿、心功能异常等。但这些疾病的发病机理尚未完全阐明。而表观遗传学，尤其是DNA甲基化可能为揭示急、慢性高原病的发病机理研究提供新的方向。

目前认为慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)的发生与人体对高原低氧逐渐失代偿有关。随着缺氧时间的推移，机体会继发红细胞过度增殖及肺小血管痉挛及重构，严重者可出现全身脏器功能的紊乱。其中红细胞增多症发病率最高且危害极大[22]。在低氧条件下，红细胞适量增多可增加外周血含氧量，然而，过量的红细胞生成则会导致血液粘稠，致毛细血管血流阻力增大，加重组织缺氧，最终可导致心肌重构及心功能受损等。随着研究者对高原红细胞增多症机制的深入探讨，发现DNA甲基化可能参与该病的发病过程及病情进展。

有研究者以安第斯高原发病的男性青年红细胞增多症患者为研究对象，对其外周血单个核细胞进行全基因组甲基化测序，发现这些患者的EGLN1基因处于超甲基化状态[6]。PHD2由EGLN1基因编码而成，它是调节HIF稳定性的一种重要酶类。在常氧下，依赖于氧含量变化的负性调节因子PHD可加速催化HIF-1α亚基脯氨酸的羟基化过程，羟基化的HIF-1α可被肿瘤抑癌蛋白(pVHL)特异地识别并与之迅速结合，最终促进HIF-1α的降解[23]。与此相反，低氧时HIF-1α并不能被PHD羟基化，使α亚基逃避了pVHL的识别。HIF-1α大量累积会促使HIF-1复合物与HRE及相关辅助因子的结合，最终调控下游基因的转录反应以增强细胞对低氧的适应[24]。所以当EGLN1基因发生甲基化时，PHD2表达水平减低，HIF稳定性增高，最终导致HIF介导的低氧转录反应增加、过量的红细胞生成，高原红细胞增多症由此发生。Minamishima Y等[25]将大鼠EGLN1基因失活，发现大鼠红细胞数量明显增加。Percy M 等[26]发现家族聚集性发病的红细胞增多症患者的EGLN1基因发生了突变，证明了由此导致的PHD2酶活性显著降低与该病的发生有关。这两项研究从侧面反映了EGLN1基因表达异常与红细胞增多症的关系。

pVHL蛋白表达水平异常也可能参与红细胞增多症的发病。丘氏红细胞增多症是常染色体遗传病，其发病机制为 VHL基因中的C、T错义突变，导致pVHL蛋白表达下降、抑制HIF-1α降解并使其在细胞中累积，加速EPO等靶基因表达，导致红细胞过度增殖。马晓燕等[27]对高原地区红细胞增多症患者外周血基因的表达水平进行分析，发现VHL基因的拷贝数减少，且与该疾病的发生、发展显著相关。鉴于此，笔者猜测慢性低氧环境导致的红细胞增多症的发病与VHL基因的甲基化有关。

高原肺水肿(HAPE)是一种严重的高原地区特发疾病，主要是低氧引起肺小动脉痉挛及毛细血管壁通透性增高，最终导致肺间质等组织发生水肿。apelin是一种与高海拔生理相关的氧稳态调节因子，它在血管内皮生理反应中起着至关重要的作用[28]。将apelin基因敲除的小鼠置于长期低氧环境中，发现一氧化氮表达水平下降，最终导致血管收缩[29]。有研究者[30]对HAPE患者和同海拔健康人群进行了一项全基因组差异甲基化片段测序的研究，发现HAPE患者组中apelin基因CpG岛的甲基化率为11.92%，显著高于同海拔健康人群，同时apelin表达下调，提示apelin基因的甲基水平与HAPE发病相关。这些结果表明DNA甲基化可能是高原低氧适应不全相关疾病的重要发病机制。

3 总结及展望

人类对高原慢性低氧的适应及适应不全是多种机制互相作用的结果，而表观遗传学被认为是连接环境因素及基因组学的中心枢纽[6]。本综述认为DNA甲基化是人类对慢性高原低氧的适应及适应不全的重要分子机制之一。目前DNA甲基化在高原慢性低氧条件下的相关研究较少，研究起来也存在诸多困难。首先，DNA甲基化具有组织及细胞特异性，通常获得目的组织或器官的纯化细胞较困难，而且，所选择的组织或细胞并不能完全地反映靶器官的表观遗传学变化。此外，生活在高海拔地区的人们除了经历慢性低氧外，还会受到强紫外线辐射和传染性病原体及污染物的影响，而表观遗传学对环境因素的改变具有敏感性，因此这也增加了描述高海拔人群DNA甲基化变化与低氧关系的困难程度。尽管高原低氧条件下表观遗传学的研究存在诸多困难，但是表观遗传学作为基因组及环境之间的一个重要衔接点，可以灵活地将基因组的遗传信息转化为对特定环境条件下的生理反应。因此，在慢性高原低氧环境下，对DNA甲基化等表观遗传学进行深入研究，有助于明确低氧及基因组学之间互相作用的关系，也加深了人类对慢性低氧环境适应机制的理解。