急性高温胁迫对虹鳟二倍体和三倍体 幼鱼hsps基因表达的影响❋

辛苑茹， 温海深， 李吉方， 侯志帅， 张美昭， 车德钊， 陈落落

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学), 山东 青岛 266003)

鱼类属于变温动物，水温是影响鱼类生长发育最重要的环境因子之一。虹鳟(Oncorhynchusmykiss)隶属于鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)大马哈鱼属(Oncorhynchus)，是全球性养殖的高经济价值的冷水性优良养殖品种[1]。其最适宜水温在12～18 ℃之间，当季节改变，尤其是夏季高温天气引起水温升高时，会导致虹鳟在新陈代谢，生长发育等方面面临挑战。当水温高于20 ℃时，鱼体表现为食欲减退，生长减缓。当水温高于24 ℃时，虹鳟停止摄食，长时间持续高温则导致虹鳟患病、死亡，带来巨大的经济损失[2]。

处于不良环境时，有机体处于胁迫状态，此时有机体会通过各个层次的生理活动回应不良环境的刺激，维持生理稳态。在神经内分泌水平上，嗜铬细胞释放儿茶酚胺类激素，下丘脑-垂体-肾间组织轴释放糖皮质激素(如皮质醇)，上述两类激素共同调控鱼类的初级胁迫反应[3]。在细胞水平上，细胞内部的蛋白质发生合成和表达的变化从而使机体表现出一系列行为和生理上的改变，进而抵抗不良环境的刺激[4]。最显著的特点之一便是热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表达的增加[5]。热休克蛋白也称为应激蛋白(Stress protein)，广泛存在于生物体中，帮助有机体应对热胁迫、渗透压胁迫、重金属胁迫、饥饿胁迫、低氧胁迫等各种不良环境。按照蛋白质分子量不同，HSPS可分为分子量较大的HSP70家族、HSP90家族和HSP60家族，以及小分子HSP家族及泛素。许多研究表明，高温胁迫能够显著影响鱼类hsps基因mRNA转录水平。周彦静提出[6]，虹鳟鳃、中肾、脑、心脏和肌肉中hsp90α表达量随水温的升高呈逐步上升的趋势。李珍提出热应激过程中[7]，心脏、脑和肝脏中hsp40、hsp90β的表达量较高。由于鱼类存在基因组的加倍[8]，导致热休克蛋白在鱼类中出现了许多亚型，在鱼类中尚不清楚何种热休克蛋白的亚型为应激型[9]。此外，不同亚型的热休克蛋白面对应激的应答幅度也不尽相同。由于hsp70s和hsp90s在虹鳟中具有诸多亚型，探究热胁迫状态下不同hsps亚型普遍的和特异的生理功能，对了解虹鳟适应热胁迫的生理机制具有重要的生理意义。

多倍体诱导技术在鱼类育种中得到了广泛应用，人工诱导多倍体也获得了成功。多倍体鱼类具有生长快、体型大等经济价值。同时由于三倍体雌性虹鳟性腺不发育，即使养殖个体逃逸到天然水体中，也不会污染本地基因库，因此具有极大的推广价值[10]。然而，当处于生长的次优条件时，或者与二倍体鱼类混养时，与二倍体鱼类相比，三倍体鱼类具有较差的抗逆性，表现出较差的生长状况，三倍体鱼类对于环境的要求更加苛刻，三倍体鲑科鱼类的抗高温能力以及抗低氧能力低于同科的二倍体鱼类。三倍体鱼类的畸形发生率更高，游动能力更差。与二倍体鱼类混养时，表现出较低的攻击性。[11]。Biron and Benfey曾研究表明[12]，二倍体和三倍体鲑科鱼类面对应激，在神经内分泌水平上无显著差异。然而，三倍体鲑科鱼在细胞层次上的应答水平尚无相关研究。由于三倍体鱼类遗传物质的增加，导致鱼类细胞核和细胞的体积增加，表面积比与体积比减小，这可能会导致一些分子进出入细胞的能力降低，因此改变了细胞面对应激时的应对水平。

在全球变暖的大背景下，黄海北部海域的水温波动剧烈，对于鱼类的养殖产生严重的影响。本研究的目的是对比二倍体和三倍体虹鳟幼鱼在应对48h热应激和48h恢复期过程中不同hsp70和hsp90基因亚型mRNA的表达变化。本研究期望探究二倍体和三倍体鱼类之间潜在的抗逆性能差异，为三倍体虹鳟的人工养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2018年6月，于山东省潍坊市临朐县寺头镇洛庄村临朐鲑鳟渔业发展有限公司进行。实验用三倍体虹鳟200尾(体长(4.764±0.099) cm，体重(1.74±0.055) g)，二倍体虹鳟200尾(体长(4.428±0.131) g，体重(1.582±0.035) g)，二倍体和三倍体所用鱼在规格上无统计学差异(P>0.05)，所有实验用鱼健康、活泼，并且为同一批次孵化。实验鱼在循环水系统中暂养1周，暂养以及实验期间全循环流水，连续充气，pH为6.6～7.0，溶氧(DO)>6 mg/L。

实验用试剂主要有，RNAiso Reagent 试剂、Taq 酶、DNaseⅠ (RNasefree)、RNasin、RNA 酶和 SYBR Premix Ex Taq 均购自 TaKaRa 公司，表达所需的引物均由华大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 实验设计和样品采集 实验设置2个对照组和2个处理组，对照组分别为二倍体对照组和三倍体对照组，处理组为二倍体处理组和三倍体处理组。2个对照组的幼鱼在96 h的实验全程中置于14 ℃水体中，2个处理组幼鱼在22 ℃水体中热应激48 h后，放入14 ℃水体中恢复48 h。每组水温误差在1 ℃以内。每个处理组设3个平行，每个平行放入20尾鱼。在实验开始的第0、6、24、48、72和96 h对4个组别的虹鳟幼鱼进行采样。每个组每次采样3尾实验鱼。

采样前将实验鱼放入MS-222麻醉剂(40～45 g/L)中麻醉，以减少采样操作对实验的影响，实验鱼无挣扎之后迅速解剖肝脏和肌肉组织，液氮中速冻然后转移至-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 总RNA的提取和cDNA的合成 按照TRIzol试剂盒的操作手册使用TRIzol试剂对样品中的总RNA进行提取，所有试验过程严格操作，谨防RNA 污染。对总RNA的浓度和纯度进行检测后视情况对RNA进行稀释，并利用takara的反转录试剂盒合成cDNA，cDNA产物置于-20 ℃储存备用。

1.2.3 实时定量PCR标准曲线的建立以及目的基因的定量测定 根据Ojima等[13]的研究成果合成hsp70a、hsp70b的引物序列。hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b、hsp90b1、hsp90b2引物序列由NCBI上所发表的根据Garcia de la serrana和Johnston[14]所研究的大西洋鲑hsp DNA序列所定位出的虹鳟cDNA序列和β-actin基因序列使用Primer 5.0软件设计引物，引物序列如下。送交华大基因合成。引物序列及PCR产物长度如表1所示。

对样品 cDNA 进行 4 倍梯度稀释，以稀释后的cDNA 为模板进行实时定量 PCR，每个模板设 3 个平行。PCR 反应体系 (共 20 μL): SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各 0.8 μL，模板 2μL，ddH2O 6 μL，ROX reference dye (50×)0.4 μL。反应条件: 95 ℃下预变性30 s，95 ℃下变性5 s，相应基因退火温度下退火30 s，75 ℃下延伸 30 s，共进行 40 个循环。实时连续测定扩增过程中产生的荧光，建立标准曲线。

对样品中的 cDNA 进行目的基因扩增，反应体系以及反应条件与标准曲线的建立一致，每个样品设 3 个重复。根据实时荧光定量 PCR 的结果，以β-actin 为内参基因，根据目的基因以及β-actin的 Ct值计算出ΔCt数值，再根据对照组目的基因以及β-actin的 Ct值计算出ΔΔCt数值，按照 2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达情况。

1.3 数据处理

试验数据均用平均值±标准误(Mean ± SEM)表达。采用SPSS 19. 0 软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较，显著性水平设为0.05。使用GraphPad Prism 5对数据进行作图。

表 1 虹鳟 hsps家族和 β-actin基因表达所用引物Table 1 Primers used in gene expression of hsps and β-actin genes in rainbow trout

2 结果

2.1 热胁迫期间，肝脏与肌肉hsp70a、hsp70b基因的相对表达

热胁迫期间，不同倍性虹鳟肝脏与肌肉hsp70a、hsp70b基因的相对表达如图1所示。二倍体、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp70a基因的相对表达在热胁迫6h后均显著升高(P<0.05)至峰值，在热胁迫48 h后，二倍体虹鳟肝脏hsp70a基因的相对表达恢复到基底水平，与热胁迫前无显著差异(P>0.05，见图1A)。二倍体虹鳟肌肉、三倍体虹鳟肝脏与肌肉的hsp70a基因相对表达在热胁迫72 h后恢复，与热胁迫前(0 h)无显著差异(P>0.05，见图1A)。

二倍体、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp70b基因的相对表达在热胁迫6 h后显著升高(P<0.05)，在热胁迫48 h后显著下降，与热胁迫前(0 h)无显著差异(P>0.05，见图1B)。二倍体虹鳟肝脏、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp70b基因的相对表达在热胁迫6 h后达到峰值，而二倍体虹鳟肌肉的hsp70b基因相对表达量在热胁迫24 h后达到峰值(见图1B)。

2.2 热胁迫期间，肝脏与肌肉hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b和hsp90b2基因的相对表达

热胁迫期间，不同倍性虹鳟肝脏与肌肉hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b、hsp90b1和hsp90b2基因的相对表达如图2所示。二倍体、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp90a1a基因的相对表达在热胁迫6 h后均显著升高(P<0.05)，在热胁迫48 h后显著下降，二倍体、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp90a1a基因的相对表达在72 h恢复到基底水平，与热胁迫前无显著差异(P>0.05，见图2A)。二倍体虹鳟肝脏与肌肉、三倍体虹鳟肌肉hsp90a1a基因的相对表达在热胁迫6 h后达到峰值，而三倍体虹鳟肝脏的hsp90a1a基因相对表达量在热胁迫24 h后达到峰值(见图2A)。

(图中不同字母表示同一组织不同时间点存在显著性差异(P< 0.05，单因素方差分析与Duncan’s多重比较)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple range test).)

图1 急性高温胁迫对二倍体、三倍体虹鳟幼鱼肝脏和 肌肉hsp70smRNA表达水平的影响(n=3)
Fig.1 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp70smRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

二倍体、三倍体虹鳟肝脏和肌肉hsp90a1b基因的相对表达在热胁迫6 h后显著升高(P<0.05)，在热胁迫48 h后，开始下降。二倍体虹鳟肝脏与肌肉、三倍体虹鳟肌肉hsp90a1b基因的相对表达量在热胁迫24 h后达到峰值，而三倍体虹鳟肝脏hsp90a1b基因的相对表达量在6h后达到峰值。在热胁迫48 h后，二倍体和三倍体虹鳟肝脏hsp90a1b基因的相对表达恢复至热胁迫前水平(P>0.05，见图2B)。而二倍体和三倍体虹鳟肌肉hsp90a1b基因的相对表达在热胁迫72 h后才恢复至基底水平(见图2B)。

二倍体、三倍体鳟肝脏与肌肉hsp90a2a基因的相对表达在热胁迫6 h后均显著升高(P<0.05)至峰值，在热胁迫48 h后开始下降。二倍体虹鳟肝脏和三倍体虹鳟肌肉hsp90a2a基因的相对表达在热胁迫48 h后恢复至实验开始前水平(P>0.05，见图2C)。而二倍体虹鳟肌肉和三倍体虹鳟肝脏hsp90a2a基因相对表达量在72 h后才回复至基底水平(见图2C)。

(图中不同字母表示同一组织不同时间点存在显著性差异(P< 0.05，单因素方差分析与Duncan’s多重比较)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple Range test).)

图2 急性高温胁迫对二倍体、三倍体虹鳟幼鱼肝脏和 肌肉hsp90a家族 mRNA表达水平的影响(n=3)
Fig.2 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp90amRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout(n=3)

二倍体、三倍体鳟肝脏与肌肉hsp90a2b基因的相对表达在热胁迫6 h后均显著升高(P<0.05)至峰值，在热胁迫24 h后开始下降。三倍体虹鳟肌肉在热胁迫24 h后hsp90a2b基因相对表达量恢复到实验前水平，而三倍体虹鳟肝脏，二倍体虹鳟肌肉，二倍体虹鳟肝脏分别在在热胁迫48、72和96 h后hsp90a2b基因相对表达量恢复到实验前水平(P>0.05，见图2D)。

(图中不同字母表示同一组织不同时间点存在显著性差异(P< 0.05，单因素方差分析与Duncan’s多重比较)。Different letters in one sample time indicate significant differences within same tissue (P<0.05, one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple Range test).)

图3 急性高温胁迫对二倍体、三倍体虹鳟幼鱼肝脏和 肌肉hsp90b家族mRNA表达水平的影响(n=3)
Fig.3 Effect of high temperature on hepatic and musclehsp90bmRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

二倍体虹鳟肝脏hsp90b1基因相对表达量在热胁迫6 h后显著上升并且达到峰值(P<0.05)，随后开始下降，在热胁迫72 h后表达量降低到实验开始前的水平(P>0.05，见图2E)。三倍体虹鳟肝脏hsp90b1基因相对表达量在24 h达到最高水平，随后逐渐下降，在96 h降低回实验开始前水平。二倍体、三倍体虹鳟肌肉组织中hsp90b1基因的表达量在第6 h升高，但二倍体幼鱼增加量不显著，随后在第24 h降低至实验前水平，二倍体、三倍性虹鳟肌肉中hsp90b1表达量分别又在72和48 h时再次升高，在实验结束后没有恢复到胁迫前水平(P>0.05，见图3A)。

二倍体、三倍体虹鳟肝脏和肌肉hsp90b2基因相对表达量在热胁迫6 h后显著升高(P<0.05)，在热胁迫48 h后显著下降与热胁迫前(0 h)无显著差异(P>0.05，见图2F)二倍体虹鳟肌肉、三倍体虹鳟肝脏与肌肉hsp90b2基因的相对表达在热胁迫6 h后达到峰值，而二倍体虹鳟肝脏的hsp90b2基因相对表达量在热胁迫24 h后达到峰值(见图3B)。

由此可见，尽管hsp70s和hsp90s的各个成员均能对高温胁迫做出反应，但各个基因亚型具有组织特异性和时间特异性，且各个基因的应答幅度也不尽相同。

2.3 热胁迫期间，二倍体、三倍体虹鳟hsp70s、 hsp90s基因的相对表达

在热胁迫开始48 h时间内，二倍体、三倍体虹鳟幼鱼均有游动失去平衡的情况出现。在热胁迫实验过程中，二倍体、三倍体处理组均无死亡现象。

由图4可知，在热胁迫开始之前(0 h)，二倍体、三倍体虹鳟幼鱼hsps的基础表达量无显著差异(P<0.05)，表达量很低或基本不表达。热胁迫后，二倍体、三倍体虹鳟的肝脏和肌肉组织hsp70s、hsp90s基因的相对表达量具有相同的变化趋势。在hsps相对表达量的峰值的时间点，即热胁迫开始后6和24 h，三倍体虹鳟hsps基因相对表达量显著高于二倍体虹鳟hsps基因相对表达量(P<0.05)。

3 讨论

鱼类属于变温动物，因此水温是影响鱼类生长发育最重要的因素之一。虹鳟属于冷水性鱼类，最适水温为12～18 ℃，在较大水体，溶氧丰富的情况下可忍受24 ℃的温度[1]。基于此进行了预实验，实验设置14(对照组)、18、22和26 ℃ 4个水平进行预实验，每个处理组放鱼30尾，记录每一组鱼类的生理情况。结果发现26 ℃处理下的虹鳟幼鱼在48 h之内有50%以上个体出现平衡或鳃盖停止运动情况出现。因此在正式试验中选择22 ℃作为高温处理的温度，以便于在48 h之后将水温恢复到14 ℃鱼体能够恢复正常游动。

本文首次在高温胁迫下，对hsp70s和hsp90s基因各个亚型在二倍体、三倍体虹鳟肝脏和肌肉中的表达量进行了定量测定。本研究中，hsp70s和hsp90s家族的8个基因亚型在热胁迫后表达量均显著增加。其他硬骨鱼的研究也发现，热胁迫导致hsp70a和hsp70bmRNA转录水平和其蛋白表达水平的增高。本文对hsp70a和hsp70bmRNA转录水平进行直接比较，在虹鳟幼鱼的肝脏组织中，hsp70a基因的相对表达量最高升高了198.22倍，hsp70b基因的相对表达量升高了297.88倍，暗示hsp70b基因对热胁迫更为敏感，与Ojima等[13]使用虹鳟RTG-2(虹鳟性腺细胞系)细胞的结果一致。相比于hsp70s2个亚型，hsp90s具有更多亚型，在本研究中观察到了全部6个亚型的表达水平的改变。其中二倍体幼鱼肝脏表达量增加倍数由多到少分别为：hsp90a2a(2036.58倍)、hsp90a2b(396.67倍)、hsp90b2(24.17倍)、hsp90a1b(16.97倍)、hsp90a1a(11.89倍)；而在二倍体虹鳟幼鱼肝脏组织中hsp90b1 mRNA水平没有显著升高。三倍体幼鱼肝脏表达量倍数由多到少分别为：hsp90a2a(3 188.07倍)、hsp90a2b(1 823.26倍)、hsp90a1b(753.52倍)、hsp90b2(357.07倍)、hsp90a1a(34.12倍)、hsp90b1(3.59倍)。前人研究证实虹鳟成鱼hspsmRNA的表达水平与日龄相关，Basu等[15]认为随虹鳟生长发育，应激反应有所降低。基于以上结论，我们推测虹鳟对急性高温胁迫作出反应的主要hsps家族是hsp70(hsp70a、hsp70b)和hsp90家族的两个成员(hsp90a2a、hsp90a2b)。同样的结果也在高温处理后的斑马鱼(Daniorerio)[16]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[17]、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)[18]中被观察到。并且在我们的实验中，hsp90s(hsp90a2a、hsp90a2b)家族mRNA应答水平高于hsp70s和hsp90s的其他亚型。

(图中相同字母不同大小写表示不同组织同一个时间点存在显著性差异(P<0.05，独立样本t检验)。Diffenent capital letters indicate significant differnces at same time point of the same tissue of diploid and triploid juvenile fish ( followed by indenpent t-test).)

图4 急性高温胁迫对二倍体、三倍体虹鳟幼鱼肝脏和肌肉hspsmRNA表达水平的影响(n=3)
Fig.4 Effect of high temperatur on hepatic and musclehspsmRNA expressions of diploid and triploid juvenile rainbow trout (n=3)

在虹鳟二倍体幼鱼肌肉组织中，高温胁迫后hsp70b表达显著升高548.80倍，hsp70a基因表达显著升高895.72倍；并且hsp90s6个亚型在肌肉组织中应答幅度也不尽相同，分别为：hsp90a2a(550.75倍)、hsp90a2b(236.40倍)、hp90a1b(150.56倍)、hsp90a1a(60.97倍)、hsp90b1(5.64倍)，而在二倍体幼鱼肌肉组织中hsp90b2 mRNA水平没有显著升高。在虹鳟三倍体幼鱼肌肉组织中，高温胁迫后hsp70b表达显著升高383.97倍，hsp70a基因表达显著增高8524.33倍；并且hsp90s6个亚型应答幅度也各有差异，分别为：hsp90a2a(2 655.96倍)、hsp90a1b(1 263.69倍)、hsp90a2b(674.22倍)、hsp90a1a(218.79倍)、hsp90b2(61.88倍)、hsp90b1(21.74倍)。因此我们推测对热胁迫作出反应的主要hsps家族是hsp70(hsp70a、hsp70b)和hsp90家族的4个成员(hsp90a1a、hsp90a1b、hsp90a2a、hsp90a2b)，并且hsp70smRNA应答水平高于hsp90s。

HSPs是有机体在应激状态下重要的应激蛋白之一，hsps基因在生物体稳态时表达量较低或不表达。当有机体遭遇外界不良环境刺激时，机体增强hsps的转录与翻译。HSPs的生物学功能十分广泛，不仅能够维持蛋白质的空间构象，拯救或降解环境刺激导致的蛋白质错误折叠，在未折叠多肽链的折叠，蛋白质组装及运输，蛋白质的加工和降解等各方面都起到了至关重要的作用，由于本身不参与大分子蛋白质的组成而只起到调节活性的作用，因此被称为“分子伴侣(Molecular Chaperone)”[19]。HSP70家族分为HSP70, HSC70, GRP78和GRP75[20]。其中hsp70为诱导型，即在正常细胞中不表达或表达量很少，但在应激源刺激下则大量表达。由于hsp70基因没有内含子，转录过程初始便可以快速合成hsp70蛋白。近年研究发现hsp70b也无内含子[21]，为热诱导表达，基础表达量很低。在正常情况下hsp呈现负反馈调节，hsp70smRNA的半衰期仅有20 min左右，而在应激状态下，hsp70smRNA稳定性增强，半衰期可延长至4h。因此我们推测在热应激环境中，有机体通过增强hsp70s的转录和延长hsp70s的半衰期，维持hsp70s的高表达水平。

不同内、外环境因素对有机体的hsp90a和hsp90b表达水平的影响不同。hsp90a更容易受到温度诱导，而hsp90b主要受有丝分裂影响，与细胞分化和细胞结构有关[22]。虹鳟hsp90b1基因在热胁迫后48 h表达水平显著上升，与其他基因变化趋势不同。我们推测虹鳟幼鱼在前48 h处于一个高于最适水温的环境中，处于胁迫状态，机体迅速产生hsps保护机体免受损伤，提高细胞对热环境的耐受力。然而在48 h后，将水温降至14 ℃，虽然此时水温是虹鳟的最适生长水温，但是温度的突然变化仍可视作对有机体的胁迫，因此hsp水平在水温发生降低之后仍有一个小的上涨。在对几种抗氧化酶即超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)的酶活性测定过程中，也发现了在48 h时酶活性的上升此种类似的现象，表明hsps的mRNA表达增高与几类抗氧化酶水平的增高是相一致的。激素和酶活性的变化往往发生在瞬间，不能作为可靠的应激指标，将hsp的mRNA表达水平作为动物应激水平和体质健康的评判标准更为准确。

本研究的目的之一是对比二倍体、三倍体虹鳟幼鱼对温度胁迫是否有分子响应水平的差异，未受胁迫的正常生理状态下，二倍体、三倍体幼鱼的红细胞比容(Hct)在许多物种中无显著差异，皮质醇，抗氧化酶，葡萄糖等水平也无显著差异[23]。本研究中，二倍体、三倍体幼鱼hsps各个基因的基础表达量无显著差异，与生理生化指标所显示的结果相类似。在应激过程中，三倍体虹鳟hsps的mRNA表达的峰值显著性高于二倍体虹鳟。我们推测热应激后，虹鳟肝脏和肌肉细胞的蛋白质合成受到影响，大量的蛋白质因热胁迫而错误折叠，无法行驶正常的生理功能。此外，大量错误折叠的蛋白质会在细胞(特别是内质网中)中累积，进一步引起细胞的氧化损伤，并大量积累活性氧类物质(Reactive oxygen species)，进而导致细胞的死亡。已知HSPs作为分子伴侣，可以拯救错误折叠的蛋白质，或是通过内质网降解构象异常的蛋白质(ER-associated degradation)[24]。本实验发现热胁迫后三倍体虹鳟hsps的mRNA表达水平更高，暗示三倍体虹鳟可以通过HSPs拯救错误的蛋白质折叠，降低细胞的氧化损伤。与我们的结果一致，Su[25]认为HSP70能提高抗氧化酶类的活性，进而消除游离的氧自由基，保护细胞免受氧化损伤。

在整个热胁迫的过程中，二倍体、三倍体实验组鱼类都没有出现死亡问题，这一结果表明本实验所选取的高温没有超过虹鳟的耐受限度，仍在其可以调节的范围之内。Kazumi等[26]认为，机体hsp70表达较高时，机体具有更强的应激能力，可以适应较大范围的温差变化。在医学研究中，Li等提出HSP与蛋白质的折叠，激活，转运与降解有关[27]。有研究认为HSP的功能不仅局限于改正错误折叠的蛋白质，还参与激活某些提供保护机制的关键蛋白，并帮助这些蛋白质转运到靶位点，例如HSP可以稳定重要的免疫识别蛋白NLRs (Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors)，提高有机体的非获得性免疫系统功能[28]。本实验中三倍体虹鳟HSP的升高可以拯救错误折叠的蛋白质和消除游离的氧化自由基，为机体提供保护。

4 结语

本研究发现，虹鳟幼鱼hsp70s和hsp90s的各成员均能对高温胁迫做出反应，但各基因亚型具有组织特异性和时间特异性，且各个基因的应答幅度也不尽相同。热应激6～24 h，三倍体幼鱼肝脏和肌肉组织hsps的表达水平均显著高于二倍体幼鱼组织。表明三倍体虹鳟受到热胁迫后，肌肉和肝脏细胞可以大量合成HSPs，拯救或清除错误折叠的蛋白质，维持细胞内蛋白质的稳态(Homeostasis)，维持蛋白质正常的生理功能，保护细胞免受蛋白质错误折叠而产生的氧化损伤、死亡。三倍体能够通过更高的hsp表达，抵抗环境胁迫。