食品中微生物污染分析及其检测技术

□孟云 3M中国有限公司

□张燕 北京家乐福商业有限公司

由于国内食品安全问题种类繁多，本文挑选目前关注度较高且风险较高的微生物污染进行分析，并将微生物污染分为3类，即细菌污染、真菌污染和病毒污染。笔者剖析以上3种微生物污染的危害及对食品行业和消费者的影响，介绍主流食源性致病菌微生物检测技术，包括传统的培养技术及现代检测技术等多种检测方法，并分析各自的优缺点，如传统的培养基方法、测试片方法、显微镜检测法、分子生物学方法、酶联免疫法及ATP生物荧光法等经典方法，以期为广大食品检测者提供选择参考性依据。

食品安全是全球广泛关注的问题，近年来我国也屡屡发生因食品污染引发的食物中毒事件，而2008年的三鹿奶粉事件更加促使人们对食品安全的进一步关注。有统计显示，在影响中国食品安全的诸多因素中，微生物污染高居首位。根据中国卫生部通报，在我国1990～1999年间发生的食物中毒事件中，微生物食物中毒居各类食物中毒病原的首位，是威胁中国食品安全的头号杀手。2007年报告的食物中毒事件中，微生物食物中毒的人数占总数的58.86%。

1 食品中微生物污染的特点及其危害性

食品的微生物污染通常由一些致病微生物引起，主要包括细菌、真菌和病毒3类。由于微生物具有较强的生态适应性，食品原料在种植、收获、饲养、捕捞、加工、包装、运输、销售、保存及食用等众多环节都可能被微生物污染。同时，微生物具有易变异性，未来可能不断有新的病原微生物威胁食品安全和人类健康。相较于其他化学污染来说，食品易受微生物污染的特点是与生俱来的，由于微生物在空气、水、人体等环境中无所不在，这使其成为食品加工过程中无法杜绝污染的因素之一。可以说，现代食品安全管理中，微生物污染是头等大事，食品生产者必须足够重视，才有可能将其危害控制在安全水平之下。

1.1 细菌性污染

细菌性污染是涉及面最广、影响最大、问题最多的一类食品污染，其引起的食物中毒在所有食物中毒中具有普遍性并极具爆发性。细菌性食物中毒全年皆可发生，具有易发性和普遍性等特点，对人类健康有较大的威胁。

引起食品污染的微生物主要有沙门氏菌、副溶血性弧菌（Bibrio parahemolyticus）、 志 贺 菌（Shigella）、葡萄球菌等。近年来，变形菌属、李斯特菌（Listeria）、大肠菌科、弧菌属（Vibrio）引起的食品污染呈上升趋势：美国1999年沙门氏菌发病1400万例，住院16430人，死亡582人，损失达23亿美元，其中96%的患者由于摄入受污染食物而被感染；1992年印度爆发霍乱弧菌（Vibrio comma）O139中毒事件，波及孟加拉、巴基斯坦等许多国家；1996年5～8月，日本爆发大肠杆菌O157中毒事件，中毒人数过万，死亡11人；1999年在美国、2000年在法国也发生过李斯特菌中毒事件……根据美国食品和药物管理局（FDA）统计，2000～2005年，美国共有470人因饮用生牛奶而感染埃希氏大肠杆菌，总共发生中毒事件18起，涉及16个州。我国食品的细菌性污染现象也非常普遍，其主要是由蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、副溶血性弧菌和沙门氏菌等微生物引起的食物中毒事件。

1.2 真菌性污染

真菌在发酵食品行业的应用非常广泛，但许多真菌也会产生真菌毒素，从而引起食品污染。尤其是20世纪60年代发现具有强致癌性的黄曲霉素以来，真菌与真菌毒素对食品的污染日益引起各方重视。真菌毒素不仅具有较强的急性毒性和慢性毒性，还具有致癌、致畸、致突变性，如黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生的黄曲霉素，麦角菌（Claviceps purpurea）产生的麦角碱，以及杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、构巢曲霉（Aspergillusnidulans）产生的杂色曲霉素等。真菌毒素的毒性可以分为神经毒、肝脏毒、肾脏毒、细胞毒等，如黄曲霉素具有强烈的肝脏毒，可以引起肝癌。

常见的产毒真菌主要有曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、镰刀菌（Fusarium）、交链孢霉（Alternaria）等。由于真菌生长繁殖及产生毒素需要一定的温度与湿度，因此真菌性食物中毒往往有较为明显的季节性和地区性。在我国北方地区食品中黄曲霉素B1污染较轻，而长江沿岸和长江以南地区则较重。有调查发现，肝癌等癌症的发病率与当地的粮食霉变现象有一定关系。

1.3 病毒性污染

与细菌、真菌不同，病毒的繁殖离不开宿主，所以病毒往往先污染动物性食品，然后通过宿主、食物等媒介进一步传播。带有病毒的水产品、患病动物的乳/肉制品一般是病毒性食物中毒的起源。同细菌、真菌引起的病变相比，食源性病毒引发的疾病更加难以得到有效治疗，且更容易爆发流行。

常见食源性病毒主要有甲型肝炎病毒（HepatitisA）、戊型肝炎病毒（Hepatitis E）、轮状病毒（Rotavirus）、诺瓦克病毒（Norwalk）、朊病毒（Prion）、禽流感病毒（Avian influenza）等，这些病毒曾经或仍在肆虐，造成了许多重大的疾病群发事件。1988年初，上海市区居民因食用被甲型肝炎病毒污染的毛蚶（Scapharca subcrenata）而导致甲型肝炎爆发流行，发病人数达30万；由朊病毒引起的疯牛病于1986年首先在英国被确认，迄今为止，全球共有100余人死于这一病症，据估计，西欧已有50万人被疯牛病病毒所感染；自H5N1型高致病性禽流感病毒引起的禽流感疫情爆发以来，全球各地不乏有死亡病例报道；美国目前每年约有2300万例诺瓦克（诺如）病毒性胃肠炎。

2 食品中微生物的检测技术及其趋势

2.1 传统检测方法

2.1.1 琼脂平板培养法

因培养基不同，琼脂平板法分为选择性培养基检测法和显色培养基检测法。选择性培养基是在培养基中加入选择性抑制剂来抑制非目标微生物生长；显色培养基是在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，以菌落颜色区分目的菌落与非目的菌落。

2.1.2 显微镜镜检法

将待测样品中的微生物富集后，于油镜下直接计数。显微镜镜检法通常与琼脂平板培养法结合使用，通过琼脂平板培养法对菌落进行定性分析，再用显微镜进行定量计数。传统检测方法虽然对设备要求不高，技术含量也偏低，但耗时长，人工消耗量大，一般检测实验室可根据实际情况合理挑选检测方法，无需拘泥于方法选择的形式。

2.1.3 微生物测试片检测技术

一般情况下，微生物测试片由印有网格的聚丙烯薄膜和覆盖有培养基和显色物质的聚乙烯薄膜组成。待测样品经过处理后可直接接种在微生物测试片上，然后放置在适宜的温度下培养——使固定在测试片上的显色物质与待检微生物生长产生的特异性酶发生显色反应，形成有颜色的菌落，通过对这些菌落进行计数便可实现检测。测试片法菌落典型，易于判读，且因其操作简便、计数直观，多数可缩短培养周期从而快速得到结果，而且人为操作环节较少，商品化程度高，避免了因人为因素造成误差较大的缺点。

测试片法是最为成熟的食源性微生物快速检测方法之一。对于一些热敏感的细菌，由于测试片在整个操作过程中均处于常温环境，可有效避免热损伤，因此能够提供更加精准的计数结果。目前，市场上较为成熟的系列微生物测试片主要生产厂家包括美国3M公司、德国默克公司、北京陆桥公司、北京良润生物科技有限公司等，该测试片可分别检测菌落总数、大肠菌群及大肠杆菌计数、霉菌和酵母计数、肠杆菌科计数、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等，且微生物测试片与传统检测方法之间的相关性非常好，均可达统计学上无显著性差异。目前，因其快速简便的特性，故已广泛应用于我国食品行业和环境、过程及成品的检测。但是，由于我国国标的现状——检测方法为强制性标准，所以目前该方法仅用于工厂内控。在此，基于行业需求特点，笔者也呼吁将来国家标准可以进行改进，增加更多简便等效性方法，以方便更多的检测行业可以根据自身特点灵活应用微生物检测方法。

2.2 现代检测方法

2.2.1 分子生物学检测方法

目前，市场上对突发感染性或传染性疫情溯源及预警的需求越来越多，传统的分型技术因分辨能力有限，已无法满足以上需求，因此促进了基因分型技术的产生——从分子生物水平上研究生物大分子，包括核酸结构及其组成成分。现在已经发展起来的基因分型技术大致分为两类，即非PCR技术和PCR的技术。最初的非PCR基因分型技术是酶切和杂交方法，需要预知基因组信息，费用巨大，对操作人员的技术要求也相对较高。PCR技术的发明为食源性病原微生物的检测提供了非常有力的手段，如环介导等温核算扩增。该方法近年来被食品工业用户较多地用于致病菌快速检测，其操作简便、增菌时间短、扩增时效快且结果准确，但不足之处在于工业用户对实验室布局把控尚需改进，避免交叉污染带来的假阳性上作改进。基因分型技术不但为细菌传播动力学提供许多重要的结论，而且为进一步研究细菌种系发生特征提供了新的途径。

2.2.2 ATP生物发光法

ATP生物发光法的基本原理是基于死/活菌的ATP含量差别。活的菌体中ATP含量恒定，而菌体死亡后，由于细胞内酶的作用，菌体中的ATP将迅速被分解，因此可以通过测定待测菌体中ATP的浓度从而计算出活菌数。与传统微生物检测方法相比，ATP生物发光法检测食源性微生物时更简便灵敏、快速高效，并且相关仪器的开发应用也能同时发展起来，例如液闪计数器、照度计等小型化的测试仪器非常便于携带，适合在现场对食品卫生进行检测，可以说是目前检测微生物数目最快捷的方法之一，因此被广泛应用于微生物检验和食品生产环境清洁度的检测。ATP生物发光法的缺点在于其易受到盐分及其他化学物质、游离态等非目标的干扰，若忽略这些干扰因素，必然会使检测结果受到影响，而且此方法不能区分微生物与非微生物ATP。近年来，基于ATP技术原理，许多仪器生产厂家提供了大量解决方案用于商业无菌检测，经较短于传统方法报文后，将食品基质内的ATP进行讲解，释放微生物胞内ATP，并用仪器进行检测后，从而达到商业无菌快速检测，为广大乳品、饮料企业所欢迎的商业无菌快速检测方法。

2.2.3 酶联免疫技术

最初的免疫酶测定是使酶与抗体或抗原结合以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。经过优化发展，其逐步演变成目前应用较广的酶联免疫吸附试验（ELISA）——首先用固相载体将抗原或抗体吸附，然后在载体上对免疫酶进行染色，一段时间后用肉眼或分光光度计进行结果判定分析。酶是一种极为敏感的有机催化剂，少量的酶便可催化大量的反应，其在与抗体或抗原结合的情况下仍可保持酶本身的生物活性，且不改变抗体或抗原的特性，反应后的有色产物可用肉眼定性观察及用酶标仪等光学仪器进行精准定量检测。

3. 结语

综上所述，由于食品中微生物污染的不可避免性，食品从业者应该重视食品微生物污染，并掌握精准的检测方法选择最适合自身需求的方法，从而快速准确的找到目标微生物，完成检测的目的，准确掌握食品微生物污染的情况。因此，进一步分析污染源头，并找出最佳的合理的预防措施，方能实现食品中微生物污染监控的目的，为食品安全保驾护航。