自噬及其在缺血性脑中风中双重作用的研究进展

正常细胞受饥饿、衰老和蛋白错误折叠或聚集等因素的诱发，为应对胞内外环境应激变化，维持自身稳定，细胞发生自噬现象[1]。然而，当自噬(autophagy)的水平超过细胞所能承受的限度，则会引起细胞过度损伤甚至死亡。通常，陈旧蛋白及受损细胞器主要通过自噬降解，而短时作用蛋白则通过泛素-蛋白酶体途径降解，二者共同维持细胞存活[2]。随着对细胞自噬认知的不断提高，自噬的生物学作用与损伤神经元功能修复方面的联系逐渐显现出来，自噬与脑中风的康复治疗随即受到基础或临床医学的普遍关注。

脑中风是一种由脑组织缺血及出血导致的以神经功能缺陷为主要临床表现的急性脑血管病。该疾病具有三大特征：发病率高、致残率高和死亡率高。据数据统计表明，我国每年有约800万脑中风新发病人，年死亡人数超过200万，且年增长速率高达8.7%，其中约70%的病人因为脑中风造成神经功能严重缺陷不能独立生活，严重影响病人生活质量，加重家庭和社会负担[3]。在脑中风病人中，约80%为缺血性脑中风，又称缺血性脑损伤。当前仅有纤维组织酶原激活剂(tissue plasmagrn activator，tPA)为有效的治疗药物，但仅3 h的给药时间窗及严重的副作用如出血等，极大地限制了tPA的广泛应用[4]。此外很多在动物实验中找到的神经保护药物在临床上均未获得理想的效果，显示出严重的毒副作用。最近研究显示，自噬是一种可逆性的细胞死亡，通过针对自噬的药物治疗可明显提高脑中风梗死半影区的细胞存活，并可显著改善脑中风后的神经功能恢复。因此深入探究自噬对缺血半影区损伤神经元的修复作用及其调控机制，进而寻求有效的神经保护方案显得尤为重要。本文重点讨论自噬对神经元存活的影响，以及自噬在脑中风后的神经保护及神经损伤作用。并讨论干预自噬提高脑中风后神经保护的可能机制，为研究自噬在脑中风后的病理及药理机制提供参考。

1 自 噬

自噬即指细胞的自我吞噬，是细胞应对内外界环境应激变化而引发的一种适应性反应。在不同的条件下，自噬可发挥不同的效应。一方面，细胞通过自噬降解细胞陈旧蛋白质、损伤细胞器等实现自我更新，同时释放氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)等缓解组织内的能量供应短缺，提高损伤细胞的存活率。另一方面，当自噬过度激活或自噬不足时，则引发自噬应激，破坏细胞稳态，扰乱细胞的正常代谢，导致细胞器损伤，如触发线粒体死亡途径等，引起自噬性细胞死亡，即Ⅱ型程序型细胞死亡(programmed cell death，PCD)，对细胞有害，并参与多种疾病的致病过程[5]，与另一种Ⅰ型程序性细胞死亡有所区别，所以说自噬在疾病中有双重作用。

1.1 自噬的分类 按照生理功能和细胞内底物运送至溶酶体内被降解方式的差异，可将自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)。巨自噬是指双层膜结构自噬体(autophagosome)先包裹细胞需要降解的废弃物，并通过与溶酶体结合形成自噬溶酶体(autolysosome)，而后溶酶体酶使物质循环再利用。在生理状态下，巨自噬已被证明在中枢神经系统(central nervous system，CNS)中具有保护作用，是通常所指的自噬过程。微自噬是指溶酶体本身膜形变为溶酶体内膜泡，直接吞噬胞质、内含物和细胞器的方法。CMA是指胞质内蛋白最初与分子伴侣如热休克蛋白70(hot shock protein，HSP70)结合后被转运到溶酶体腔中，继而被溶酶体酶消化。虽然这3种主要方式发生过程不同，但在维持细胞内环境稳态方面具有共同的作用。

1.2 自噬的发生周期 具体来说自噬的产生周期可人为地将其分为自噬膜的诱导、自噬体的形成、自噬体的运输、自噬体的降解4个阶段，是一个高度调控的多步骤进程，其中最为关键是自噬体的形成。①自噬膜的诱导：在饥饿、缺血缺氧和生长因子缺乏等上游信号的刺激下，自噬前体由粗面内质网和高尔基体参与包裹降解物而形成。通过识别机制的不同将这一阶段分为有选择性和非选择性两种自噬，前者由细胞内的底物诱导发生，而后者由细胞外的刺激发生。②自噬体的形成：分隔膜经过延伸和弯曲构成 “C”形至“O”形的双层膜结构自噬体，其直径一般在500 nm左右，此过程受微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)和自噬相关基因5-12两种泛素样结合系统的调控。③自噬体的运输：自噬体通过自身的运输与溶酶体结合形成单层膜结构的自噬溶酶体。④自噬体的降解：通过溶酶体中的酶消化分解，使自噬体膜分离，并且将有用的产物如氨基酸、核苷酸等输送到胞浆中循环利用。

2 自噬对神经细胞的作用效应

细胞自噬不同于坏死和凋亡，它可以让细胞获得再生的机会。由于大部分神经细胞不能分裂，对于神经元这类不可再生的细胞来说，这个过程尤为重要，多数细胞器的更新依赖于自噬机制。分化完全的神经细胞，想要通过其他方式来恢复自身功能几乎是不可能的，倘若自噬相关基因发生突变则细胞必将受损直至死亡。例如将小鼠的自噬相关基因Atg5敲除，可导致大量蛋白聚集在神经元，自噬功能异常，出生后的几小时内小鼠便死亡[6]。此外，神经细胞自噬不仅实现自我消化，而且也为周围细胞提供原料，使细胞对抗外界不利因素的适应能力大大提高。研究表明，自噬功能缺失与缺血性疾病、神经退行性疾病、肿瘤、炎症和免疫性疾病密切相关。

3 缺血性脑中风后自噬研究的基本方法

3.1 自噬的检测 累积的证据表明，缺血性刺激后，自噬在脑组织或神经细胞中被激活。主要通过电子显微镜观察法、免疫印迹、免疫组化、免疫荧光检测，从形态学和生物化学等方面提供单个或组合的实验证据。

自噬的检测方法分为直接法和间接法两种形式，前者在于观察自噬的形态，后者则是检测自噬表达的特征蛋白。1995年，Nikoletopoulou等首次通过电子显微镜观察到双侧颈总动脉结扎的沙土鼠大脑海马CA1区的自噬现象[7]。直到现在，准确地对自噬体进行定位、定性甚至定量检测，一直是检测自噬的金指标。MAP1-LC3 是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳动物中的同源物，作为自噬体形成的标志性蛋白，其在组织中以胞浆型(LC3-Ⅰ)和膜型(LC3-Ⅱ)两种形式存在，因此，想要观察自噬水平的增强和减弱可采用Western Blot 技术分析LC3-Ⅱ/Ⅰ的灰度值[8]。Beclin1 是另一种检测自噬的起始标志物，这种自噬相关蛋白与酵母中Atg6同源。不同的是P62蛋白在自噬过程作为负调节因子，也都在研究缺血性脑中风中作为自噬的常用指标。除此之外，还有单丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin，MDC)染色法、吖啶橙(acridineorange，AO)染色法和荧光显微镜法，是基于自噬原理的特殊染色方法。

3.2 自噬的调控 细胞在正常情况下，自噬的表达水平较低，然而当神经元受到过多的外界刺激，就使得基础自噬转变为诱导自噬[9]。而在缺血性脑卒中的研究中自噬的诱导常常需要加入自噬的抑制剂和激活剂作为实验的对比验证。

主要影响自噬的调控机制大致分为磷酸肌醇三磷酸激酶(PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)、GAI3 蛋白和氨基酸、激素等[10]。这其中Ⅰ型PI3K和哺乳动物TOR(mTOR)作为抑制自噬信号的通路，而PI3K通路的Ⅲ型则作为激活自噬信号的通路。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、渥漫青霉素(Wortmannin，WM)和LY294002是研究者普遍使用的自噬抑制剂，它们都可以阻止或影响自噬体的形成，这其中最为理想的抑制效果是3-甲基腺嘌呤，作为Ⅲ型PI3K通路的抑制剂。值得关注的是，有研究表明，3-MA对自噬具有双重作用，在营养充足下，3-MA能促进自噬的发生，而在细胞饥饿条件下抑制自噬的发生[11]。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)和长春碱用于阻断自噬体与溶酶体的融合，E64d作为蛋白酶抑制剂则参与抑制溶酶体的降解。雷帕霉素(rapamycin，RAP)是mTOR的抑制剂，有助于Atg13的去磷酸化和其他自噬相关基因的活化，促进自噬的发生，是一种广泛应用的自噬激活剂[12]。

4 自噬与缺血性脑中风

在大量缺血性脑中风动物模型中发现，脑缺血可显著激活细胞的自噬活性，并可通过药物干预调节。由于自噬在缺血性脑中风后受细胞损伤的严重程度、缺血时间长短和缺血脑区部位等多种因素的影响，自噬在脑中风后的作用效应不尽相同，甚至截然相反。通过检索新近文献，自噬在脑中风后的作用归纳如下。

4.1自噬在缺血性脑中风的保护作用 在脑缺血发生的早期，为应对神经元的损伤，自噬体运载其内容物从轴突运输至胞体，与溶酶体融合后，清除受损神经细胞，保护周围的神经细胞，维持神经系统内环境的稳态，自噬被称为神经元的“管家”，轻度或中度激活自噬可提高神经细胞生存[13]。Jiang等[14]在大鼠永久性缺血前进行缺血预处理，当加入用载体化合物C(AMPK抑制剂)或自噬抑制剂3-MA后，脑梗死体积增加，神经损伤严重，表明提高自噬有助于缺血性脑中风的神经保护。Zhou等[15]分别建立了大鼠局灶性脑缺血体内动物模型和氧糖剥夺(OGD)体外细胞模型。通过腹腔注射自噬诱导剂雷帕霉素增强自噬，结果显示，脑梗死体积、脑组织中丙二醛、过氧化物歧化酶和细胞色素C水平显著下降。相反，海马神经元OGD 模型用3-MA 抑制自噬后，原代海马神经元损伤明显加重。由此推测，自噬对缺血性脑中风具有神经保护作用。Wei等[16]建立小鼠大脑中动脉诱导的缺血性脑中风实验说明，神经元特异性常规蛋白激酶C(cPKC)γ通过Akt-mTOR途径调节自噬的升高，改善了缺血性脑卒中后小鼠的神经学结果。Yan 等[17]实验得出高压氧预适应与自噬激动剂雷帕霉素具有相似的功能， LC3-Ⅱ以及Beclin1 的自噬蛋白表达升高后脑损伤减少，3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，脑损伤则加剧。值得关注的是，另有研究发现，雷帕霉素在脑缺血的初期保护作用显著，但在脑缺血末期其保护效果显著降低[18]。

4.2 自噬在缺血性脑中风的损伤作用 但也有研究者提出相反的结论，在营养匮乏、毒性刺激和低氧等应激因素的刺激下，细胞的自噬活性明显增强，当超过细胞所能承受的范围时，众多的自噬底物在轴突中积聚，迫使溶酶体逆向转运至轴突，从而使轴突运输功能紊乱，最后导致神经元受损，因此过度的激活自噬促进神经细胞大量死亡[9]。Dong等[19]用Nissl染色显示，接受Ro25-6981治疗的大鼠海马CA1锥体层神经元损伤减少，降低雷帕霉素诱导的神经元损伤和缺血再灌注后自噬的过度激活，对神经元有保护作用。Wang等[20]研究建立了大鼠远端缺血期处理和缺血后处理结合模型，通过抑制自噬减弱了血浆HMGB1水平，脑缺血再灌注损伤的神经保护作用明显，而加入自噬激活剂雷帕霉素损伤增强。Yang等[21]通过永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)在小鼠中构建了局灶性脑缺血模型，检测到体内小胶质细胞的自体吞噬和炎症反应，使用药物抑制剂3-MA抑制自噬不仅降低了小胶质细胞的自噬和炎症反应，而且降低了脑梗死面积，减少了水肿形成和神经缺陷，表明脑缺血诱导的小胶质细胞自噬增强缺血性神经炎症和损伤。Luo等[22]用右旋美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)和3-MA后处理对于用雷帕霉素处理的短暂动脉闭塞(tMCAO)模型相比较，抑制缺血周围脑组织的神经元自噬可以减少脑梗死面积并改善神经功能缺陷，增加氧糖剥夺模型中原代培养神经元的活力和凋亡，这表明在再灌注开始时抑制神经元自噬，可以保护小鼠脑免受缺血再灌注损伤，有助于提高受损神经元的存活。

4.3 自噬和缺血性脑中风相关研究的总结分析 越来越多的研究证实，自噬在缺血性脑中风后的作用十分显著。而在脑缺血前进行缺血预适应可挽救自噬造成的脑缺血损伤，其与缺血性脑卒中自噬发生的时间及程度有所区别。尽管目前关于脑缺血后自噬对神经元是保护还是损伤仍然众说纷纭，其可能存在的机制包括：以降解神经突触为神经元提供能量；降解受损的线粒体从而抑制凋亡发生；降解能量消耗来缓解细胞死亡[23]。但可以确定的是在脑缺血的初期，自噬的激活是对外界环境变化的一种适应性反应，并作为一种防御机制；而随着自噬的增加，如在脑缺血的末期，神经元损伤则以凋亡和坏死为主，原因在于自噬的保护作用及损伤作用在不同条件下可能会相互转化。使用化学药剂对自噬的非特异性和单一方法监测动物脑缺血模型自噬的可靠性等都会造成实验结果的不一致，使得必须避免动物模型个体差异的影响，设计多个监测时间点[24]。 Sadoshima 等[25]归纳总结：适度自噬可可提高缺血性脑中风后的神经保护作用，而过度自噬加剧缺血性脑中风的神经损伤。

5 展 望

自噬参与多种生理和病理过程。虽然自噬在缺血性脑中风的确切作用还存在争议，但可以确定的是，自噬可调节脑缺血半影区损伤神经元死亡和存活之间的平衡，在损伤神经元的命运转归中发挥关键作用。但清楚认识自噬发生的相关调节因素及信号通路，脑缺血时自噬与凋亡、坏死之间的转换关系及作用，以及药物对脑缺血的有效治疗方法还有待进一步研究，更加深入全面地认识自噬与缺血性脑中风的关系，以及相关的病理及药理机制，为脑中风的临床治疗提供重要的研究基础及可行性线索。