血管内膜损伤后内皮修复与再生的研究进展

血管内膜位于血管壁的最内层，由内皮和内皮下基质组成，其结构完整和功能正常对血管发挥生理功能至关重要，也是预防动脉粥样硬化及相关心脑血管疾病的关键环节。血管内膜直接与血液接触的主要是连续单细胞层的内皮细胞，因此在血管内膜损伤过程中，内皮细胞最早出现功能异常或结构破坏。血管内膜可由炎症、氧化应激、血流剪切力和医源性血管内诊疗操作等多种原因受到损伤，众多影响因素中，内膜的再内皮化(re-endothelialization)修复在损伤后愈合过程中非常重要[1]。现就近年来关于血管内膜损伤后内皮修复与再生方面研究进行综述。

1 血管内皮的生理功能

血管内皮作为血液与血管壁之间的机械屏障，同时作为内分泌器官分泌大量生理活性物质，发挥保护血管壁和维持正常血流等作用。血液层流状态下，内皮细胞(CECs)通过催化内皮型一氧化氮合酶(eNOS)生成一氧化氮(NO)，NO具有舒张血管，对抗缩血管物质如内皮素-1、血栓烷A2的作用，以维持正常的血管张力和血流状态[2]。生理状态下血管内皮细胞合成并释放组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)、血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)等抗凝物质，使得血管内血液处于轻度纤溶状态，保持血流通畅。正常血管内皮可屏蔽低密度脂蛋白或其他有害物质的侵袭、沉积到内膜下，阻断动脉粥样硬化病变的起始和进展，此作用在血管分叉及血流剪切力变化较大的动脉粥样硬化易患处显得尤为重要[3-4]。

2 血管内皮损伤的表现

2.1 内皮细胞激活 各种原因引起的内皮损伤一般首先表现为内皮细胞激活，主要为细胞表面分子高表达或细胞合成释放大分子物质增多；之后内皮细胞收缩、细胞形态改变，在细胞间连接处出现轻度断裂、不完整，导致通透性增加[5]。若持续激活，进一步导致细胞功能改变，合成与释放致病性因子如黏附分子、致炎症和致血栓分子增加，同时细胞表面结合分子如血栓调节蛋白、细胞间黏附分子等被分解脱落到血液中，此时检测血液相关物质即可反映内皮细胞激活程度[6]。若损伤刺激因子不能消除，随着时间进一步延长，引起细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生、积累，并增加细胞因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子合成、释放，继续发展会导致细胞结构破坏[7]。

2.2 内皮细胞功能障碍 内皮细胞功能障碍主要表现为内皮依赖性血管舒张功能受损、凝血/纤溶系统功能失衡及促细胞增生/促成熟分化因子活性失衡，其原因可能在于细胞持续激活后释放的活性物质发生紊乱。Otsuka等[8]综述冠状动脉内支架植入术后内皮功能障碍诱导eNOS活性下降，导致与其相关的氧化还原反应失偶联、ROS产生并积累，而NO浓度及生物利用率均下降，表现为促炎症分子和促血栓分子表达明显上调，如各种黏附分子合成释放、组织因子暴露，而抗凝血酶Ⅲ等生理性抗凝物质合成减少，引起血液血小板、丝裂原被激活，易出现血管内血栓形成及炎症反应。Janmaat等[9]小鼠模型研究发现，内皮源性NO合成减少及血小板活化后释放血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)刺激血管平滑肌细胞增殖，迁徙至内皮下层并分泌胞外基质，导致新生内膜增生(neointimal hyperplasia)，引起血管管腔狭窄。

2.3 血管腔内操作直接损伤 目前血管腔内的诊疗操作越来越普及，其中具有代表性的是经皮冠状动脉内介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)。手术操作过程中，由于在血管内扩张球囊或植入支架，可直接造成血管内膜损伤，尤其在植入紫杉醇或西罗莫司药物洗脱支架(drug eluting stent，DES)时，可从以下方面损伤血管内膜[7-8，10-11]：支架扩张时直接挤压血管内膜，剥蚀(denudation)内皮细胞，暴露内皮下基质，直接促发炎症反应，激活血小板，促发血栓形成瀑式过程，而裸露的基质表面被纤维蛋白、胶原及蛋白多糖沉积，阻碍内皮修复；受挤压但未被剥蚀的内皮细胞被持续激活，进一步增加炎性介质表达，同时释放细胞生长因子刺激平滑肌细胞增殖和迁徙，导致新生内膜增生；支架药物的多聚物载体可产生持续性炎症反应，并增强内皮细胞对炎性介质的反应，而涂层本身为细胞周期药物，局部高浓度释放可抑制内皮增殖、成熟分化及修复受损部位。

3 血管内皮自身修复

3.1 受损内皮细胞自噬修复 自噬是指细胞内的细胞器受损遭到破坏时，为避免进一步扩大损伤，部分内质网膜包裹受损的细胞器，并与溶酶体融合将其降解，之后根据代谢需要再生更新过程。通常情况下这是细胞的一种自我保护和修复机制，在自噬过度或出现病理性自噬时导致细胞自杀性死亡[12]。内皮细胞受损时，胞内出现被破坏的细胞器或异常蛋白质，细胞即启动自噬机制，自我修复，以保持自身稳态及继续生存，避免细胞死亡或凋亡；此时，内质网膜将坏死、异常物质包裹形成自噬小体，减轻由其触发的炎症反应和氧化应激反应，且适度自噬可上调eNOS表达，下调缩血管物质如内皮素-1表达，从而阻断细胞进一步损伤的分子循环[13-14]。内皮细胞受到较长时间或程度较重损伤刺激时，可诱导病理性自噬。Hayashi等[15]研究显示，冠状动脉药物支架植入后，因持续诱导产生大量活性氧簇和炎症介质，致使细胞器遭到大量破坏，若不及时干预，细胞自噬机制过度激活，造成众多自噬小体的细胞内堆积，影响细胞的生理功能和新陈代谢，最终导致细胞死亡，如此反复不利于细胞生存与修复。

3.2 内皮细胞再生修复 血管内膜破坏较严重，内皮细胞损毁数量较多时，需维持内膜的完整结构，则需要内皮细胞再生或补充，完成修复过程称为再内皮化。一般认为，再内皮化所需要的源细胞来自以下3方面并通过不同机制参与修复过程，①受损区域周边的正常内皮细胞：血管内膜受损本身刺激邻近正常内皮细胞增殖、迁徙以修复细胞缺失部位，有研究表明动物(大白兔)血管内支架植入后，通过邻近正常内皮细胞增殖迁徙，在4周内修复，完成再内皮化，人类常需要数月或更长时间[7]。②循环CECs：血液循环中的CECs来自血管内皮脱落，实质是对某一部位血管内膜损伤后的代偿反应，正常情况下血液含量甚微。目前认为，循环内皮细胞是成熟细胞，本身已无增殖能力，可能主要通过血小板内皮细胞黏附分子(PECAM-1、CD31)、血管内皮黏着蛋白(VE-cadherin、CD144)等分子间的相互作用，聚集于血管受损处，参与内膜修复[16]。③内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)：1997年日本学者Asahara等[17]从人外周血中分离CD34+单核细胞进行体外培养，发现一定条件下细胞形态可朝内皮细胞方向分化，并表达表面分子标志血管性血友病因子(vWF)、E-选择素，首次证明骨髓CD34+多能干细胞包含内皮祖细胞前体，也为今后血管内膜修复的研究提供新途径。鉴于骨髓干细胞来源的内皮祖细胞增殖能力强大，故认为是血管内膜损伤后再生修复的重要细胞来源，研究者发明多种方法增加细胞数量及辅助细胞精确定植。Yip等[18]研究发现内皮祖细胞动员受可溶性Kit配体调控，后者由基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)通过切割膜结合Kit配体生成，而tPA可明显促进这一酶切过程。血管内膜损伤作为刺激因素可动员骨髓内皮祖细胞释放入血，并通过血循环到达受损处，分化为内皮细胞进行修复，而有些药物如阿托伐他汀可进一步提高祖细胞动员数量[19]。为增加在血管内膜损伤处、尤其血管内支架术后内皮祖细胞的精确定植，研究者发明细胞捕获技术，即利用免疫学原理在支架表面负载内皮祖细胞相关的单克隆抗体，针对的抗原已从早期CD34逐渐发展为具有特异性的VE-cadherin、CD133，近期研究使用寡核苷酸适体(DNA aptamer)，动物实验显示可加速内膜修复和再内皮化[20-22]。

4 新生内膜增生的调控

血管内膜损伤尤其腔内介入治疗后有另一种血管增殖反应，即新生内膜增生为病理性修复，导致血管管腔再狭窄，其机制除局部平滑肌细胞增殖、迁徙至内膜下外，损伤导致骨髓多能干细胞动员，其中部分分化为炎症细胞和平滑肌祖细胞，参与这一病理过程[23]。目前，临床冠状动脉支架手术时，为防止新生内膜增生导致血管再狭窄，常采取强化抗血小板、调脂抗炎等药物治疗，同时支架表面覆以抗细胞增殖的药物涂层；此措施在抑制血管平滑肌增殖的同时抑制损伤边缘正常内皮细胞增殖，阻碍血管内膜正常修复及再内皮化进程[10]。一项基于microRNA为基础的策略显示了特异性抑制血管平滑肌细胞增殖而保留血管内皮修复能力的良好前景，Santulli等[24]在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，利用腺病毒搭载细胞周期依赖抑制因子p27的靶序列miR-126-3p，转入动物表达后观察发现可明显减少新生内膜增生，而对损伤部位的修复及再内皮化无影响。

5 影响内皮再生及修复能力的因素

体内血管内皮再生和修复受到多种因素影响，其实质多为影响修复细胞的数量和功能。PCI术后，支架金属横梁及药物的多聚物载体为异物，在血管内膜损伤局部持续产生炎症反应，诱导氧化应激，引起邻近正常内皮细胞凋亡，或过度自噬而死亡，延缓内膜修复[25]。Chen等[26]大鼠模型实验发现，颈动脉损伤导致组织因子暴露、激活凝血酶通过蛋白酶激活受体(protease-activated receptors，PAR-1)，抑制循环中CD34阳性单核细胞凋亡，促使其向平滑肌祖细胞方向分化，从而延缓内膜愈合，增加新生内膜增生。胰岛素抵抗可阻碍内皮祖细胞动员、减少血循环中该细胞数量，并通过PI3-kinase/Akt等信号转导途径影响正常的增殖和迁徙能力，使内膜受损处内皮细胞不能得到及时更新和补充，出现明显的动脉粥样硬化病变[27]。有研究显示，衰老可因端粒缩短和染色体顶端开帽(uncaping)等导致内皮祖细胞基因组不稳定，并介导抑癌基因p53和p16/pRB的激活，终止细胞增殖周期、诱导凋亡，使细胞数量下降而减弱对受损内膜的修复能力[28]。

6 小 结

近年来，由于血管腔内介入治疗的发展，造成内膜损伤常见，快速完整修复，完成再内皮化将进一步提升疗效，激发细胞再生和增强修复能力研究方面今后将继续关注：增加内皮祖细胞的动员和定植于受损部位的能力；开发选择性抑制血管平滑肌增殖，促进血管内皮细胞增生的措施或药物；促进新生内皮细胞分化成熟，重建细胞间连接，以完善细胞的功能。