法医物证检验中常染色体STR位点突变的研究进展

赵佩翔，陈鹏宇，余丽梅

(1.遵义医科大学附属医院 贵州省细胞工程重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 司法鉴定中心，贵州 遵义 563099)

短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)分型技术具有高灵敏度、高鉴别能力、高种属特异性、结果高度准确性、易于标准化等特点，如今已作为个人识别以及亲权案件中的鉴定金标准。自1997年美国FBI设立联合检索系统(Combined DNA Index System，CODIS)以来，STR就作为第二代遗传标记并沿用至今。近年以来，CODIS核心基因工作组(CODIS core Loci Working Group)对核心基因座进行了补充，增加了7个核心基因座(包括D2S1338、D19S433、D1S1656、D12S391、D2S441、D10S1248以及DYS391)，并且剔除了TPOX基因座形成了19个新的CODIS核心基因座[1]。

与性染色体相比，23对常染色体中已经发现并应用的STR位点数量十分庞大，联合PCR-STR技术能够提供大量基因座的等位基因信息，在这样的复合扩增系统中累计个人识别力(the combined power of discrimination,CPD)及累计非父排除率(the combined power of exclusion,CPE)都能满足司法鉴定的系统效能要求，从而为法医物证检案提供可靠丰富的数据来源[2]。同时，在亲权案件中，性染色体STR主要作为辅助指标，选择性染色体也会受到被鉴定人的性别的影响，常常较局限，而常染色体STR适用大部分亲权鉴定案件类型，是公安、司法鉴定中心以及第三方检测机构在刑事侦查、亲权鉴定、个人识别等法医物证领域首选的遗传标记。

1 STR突变的法医学意义

实际工作中发现，贵州汉族人群中STR等位基因是具有良好的多态性[3]，同时STR的突变也时有发生，其实质是STR的等位基因在亲代与子代之间不符合遗传规律的现象。理论上，亲权鉴定案件当中选用的STR基因座突变率较低，这是因为基于孩子与亲代的等位基因在遗传过程中能够保持稳定遗传的假设，通常每1 000减数分裂发生1～4次突变[4](突变率为0.1%～0.4%)。然而在计算累计亲权指数(Combined paternity index，CPI)时必须考虑STR突变的影响，因为等位基因的突变可能会使CPI达不到行业认定标准，鉴定人员将无法给出肯定的判定意见，甚至在13个CODIS基因座基础上，不断增加到15、19、23个常染色体STR基因座，也不能完全得到支持或不支持的亲权关系鉴定意见，对日常工作造成了不能回避的风险[5-7]，应该引起司法鉴定科研人员的重视。此外后天环境或疾病因素导致STR分型结果发生改变已经为研究所证实，这些原因将对法医学判断突变造成一定的影响。因此，在亲权鉴定中，必须了解STR突变的国内外研究进展，本文从突变机制与模式、突变特征、主要影响因素以及最大连续同一重复次数(longest run of perfect repeats，LRPR)、杂合性丢失等综述了常染色体STR突变的研究进展，为法医物证的准确判断和科学研究提供理论参考。

2 STR突变的主要机制

目前广大学者普遍接受的STR突变机制最适宜的解释是DNA复制滑动(replication slippage)或称滑动错配，即若双链DNA的碱基构成近似的情况下，在DNA复制过程中双链分离时，STR的重复区域内容易出现一个或数个碱基错配的重复区域的环状结构，这种因为错配形成的碱基环可能导致新生链碱基数目的增加或减少，表现为重复单位的插入或缺失，这与重复单位的侧翼序列、重复单位及待扩增等位基因的长度有关。另外发生在染色体联会时期的不等交换(unequal crossing over)也可能在STR突变中产生一定作用，但就STR突变而言DNA滑动错配比不等交换更常见[8]。

逐步突变模式(Stepwise mutation model，SMM)是STR突变模式中的重要支持理论，即认为STR的突变是以一步突变为主，多步突变是在一步突变的基础上逐步形成，突变的步数越多，相对发生的机会也就越小，每次STR突变按照一定的突变几率增加或者减少一个重复单位[1,4]。事实上逐步突变理论存在一定缺陷，根据该理论假说，在一定的突变几率下STR可以无限增减重复单位，但在实际研究点突变与复制滑动机制关系中发现，在低于复制滑动阈值(5 ～9个重复单位)时，点突变为主导突变机制，而在较长的重复序列长度(大于10个重复单位)中，复制滑动机制占主导地位。因此，在STR的突变中以滑动错配和逐步突变为主要机制。

3 STR突变特征

3.1 突变率是研究突变的首要指标 突变率是突变案件中亲权判定的重要指标，对鉴定结果的判定有着重要的意义。目前国内外关于STR突变分析研究中都首先报道各基因座突变率，民族不同，基因座突变率也不同，甚至在某些基因座中突变率相差较大[2]。比较中国西南、南、北方三个地区汉族突变率，发现这些地区突变率最高的基因座依次是FGA、D18S51和Penta E，突变率较低都是TPOX和TH01基因座[9]。可见，突变率较直观反应被研究群体的突变特征的指标。但是突变率的计算与观察依然与样本量的选择有着直接的关系，关于突变的研究已有不少报道，但是对总样本量的选择上却有很大出入，这使得通过减数分裂次数计算的突变率差异会较大，不排除存在假阳性和假阴性的计算结果。

3.2 核心序列特征 STR突变的另一个主要特征表现在核心序列上，即基序(Motif)的变化特征，基序是指重复序列碱基组成的形式，STR突变通常表现为基序的插入或缺失。研究发现，常染色体STR的突变，主要以一步突变为主，多步突变几率相对较小，同时需值得一提的是即便是单基因座三步以上突变的案例在鉴定意见的撰写时需考虑回避风险。另外在一步突变中插入/缺失突变比例在不同人群中差异却较大，如广州中山汉族人群该比例为1.2∶1(n=376)[10]，而浙江杭州汉族人群则为1.7∶1(n=195)[11]，同样在云南昆明汉族人群插入/缺失比例没有显著差异[12]。也有研究观察到突变次数最大的FGA基因座发生突变高达25次，较小的等位基因表现为基序的插入突变，较大的等位基因倾向于基序的缺失突变,这种现象在Y-STR中也有类似研究报道[7]。因此，STR突变在突变步数、插入/缺失比例、突变趋势有着自己独特的特征，而这些特征在不同的人群中有着一定的差异，一定程度上可以间接地反应的群体多态性的特征。

4 STR突变的主要影响因素

在突变研究中，除了对群体的突变率、突变特征之外，还需要进一步考虑影响STR突变的主要影响因素,如民族、地理环境、杂合度、等位基因长度及亲代的年龄、性别，甚至需要考虑细胞的分裂活跃程度与肿瘤等疾病状态等许多因素的作用[13]。

4.1 民族与地域不同会导致突变存在差异 人类走出非洲大陆，经过了数次大规模的迁移活动，随着时间的变迁，如今人类已经遍布了全世界的每一个角落。然而相同地区不同民族，不同地区同一民族或者不同地区不同民族的人群会因为其地理环境、民族风俗的差异而被相对隔离在相对稳定的区域内，与其它地域内人群相比，既可能存在因祖辈累计遗传的某些特定基因的差异，也可能存在民族之外的地域对遗传及突变所造成的突变率、STR核心序列、重复次数等特征的改变。国内外研究发现多维标度(Multidimensional scaling)图能够将地理位置相对靠近的人群与其它相对较远的人群区分开，反应出地理位置远近与人群STR基因特征存在的差异[14-15]。同时需要注意的是，现阶段的突变分析仅是针对某一时段内某一地区的某一人群内进行研究，随着人口的迁移，交通日趋发达，城市规模逐渐扩大乃至国际通婚率的提高，STR突变分析也应是一个随着时间推移不断更新的复杂动态过程。

4.2 杂合度与突变率的相关关系 杂合度(Heterozygosity)是指在群体中某个遗传标记的全部基因型中杂合子所占的比例，除了用于群体多态性研究，同样也用于等位基因突变的相关分析，杂合度越大表明该基因座在法医应用中的价值越大。研究发现，各个基因座的期望杂合度(Expected heterozygosity，He)与该基因座突变率存在一定正相关关系[16]，即期望杂合度越大的基因座，突变率也就越高，我们知道期望杂合度的计算公式为(n为样本中等位基因或单倍型的总数，k为等位基因或单倍型的数目，pi为样本中等位基因或者单倍型的频率)。通过公式就能直观的反应，等位基因pi值应该符合该地区等位基因分布理论频率，而研究总群体的等位基因总数n的大小也对杂合度有重要影响。但在研究过程中，有不少研究人员仅统计了一个商品化STR试剂盒的突变案例，在样品量不够大的情况下，会发现很多基因座的突变率计算结果相等，而加上各个基因座杂合度差异不是很大，因而很难得出二者相关关系的有效证据。

4.3 LRPR与突变率的相关关系 LRPR实质是指计算基因座核心序列能完整或完全重复的次数，如某基因座的等位基因有9、10、10.1、12.3，则LRPR记为9、10、10、12。在法医学中，由于样本来源不同或样本例数的限制，所得到的STR某基因座的等位基因也会不尽相同，那么LRPR取值也将不同，研究中通常取某基因座全部LRPR的几何均数(geometric mean of the longest run of perfect repeats，GEO)，发现该几何均数与对应基因座的突变率存在一定相关关系[17]。LRPR的几何均数值越大，可以理解为核心序列完整重复次数越多，对应基因座的突变率越高。

4.4 父源性突变显著大于母源性突变 亲代性别作为影响因素的实质是判断STR突变来源，根据《亲权鉴定技术规范》(SF/Z JD0105001-2016)规定，在累计亲权指数大于10 000的情况下，可给予支持符合亲权关系的结论，则案件中不符合遗传规律的基因座可视为STR发生突变，随即需要判断突变来源，在三联体案件中，通常根据新产生的等位基因与父亲、母亲的等位基因比较，将距突变等位基因差异最小的一方基因定为子代等位基因的突变来源，若差异相同，则无法确定来源，所以STR突变来源可以分为“来自父亲”“来自母亲”和“无法确定”3种情况。大量研究已经明确“来自父亲”的突变显著高于“来自母亲”的突变[18]。这是因为卵(精)原细胞在形成卵母细胞和精细胞之前都会有DNA的复制以及细胞有丝分裂过程，再经过减数分裂形成配子，成年男性精子有丝分裂的次数显著高于性成熟的女性个体，使得男性生殖细胞DNA复制量最高可比女性生殖细胞的DNA复制量高出数十倍，意味着男性在配子形成过程中STR基因座发生突变的机会显著高于女性。同时，也有研究报道，精细胞上的PEDM9基因控制基因重组的过程，并与减数分裂不稳定性有关[19-20]，这种潜在的机制很可能是父源突变率高的根本原因之一。

4.5 亲代年龄与突变 亲代年龄主要指孩子出生时父母的实际年龄，也是STR突变中的重要影响因素，在精细胞形成过程中年龄较大的被检父会经历更多的细胞分裂，DNA复制次数也更多，相对发生突变的几率也会增大，在实际亲子鉴定案例中，统计发现随着被检父年龄的增大，突变率也在不断增加，二者呈现高度相关关系(︱r︱=0.99)[12]。而在母源性突变中很难见到随着年龄增长突变率递增的趋势。

5 判断STR突变需警惕杂合性丢失现象

沉默基因(silent allele)的产生可能会导致杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)的发生，即基因组正常的一对等位基因发生了某种变化，使得其中一条等位基因在扩增时丢失。Akiko Tsuji等人在研究D19S433基因座中发现[21]，测序结果显示孩子D19S433基因座为重复序列下游第32个核苷酸发生了G→A点突变，而STR分型结果为15的纯合子，与父亲13,13、母亲14,15的STR分型结果的遗传规律不符合，可能被误判为STR的突变，而导致错误的PI计算。有研究对类似情况的STR基因座峰高进行了仔细比较后发现，由于D19S433的等位基因大小101～148bp，vWA等位基因大小为151～203bp，两者大小较接近，故而D19S433的总峰高与vWA的总峰高接近(样本为杂合子，峰高取两峰高总和)，当D19S433出现沉默基因，导致LOH时，D19S433的峰高明显低于vWA基因座[22]。除了早期在TH01、FGA、vWA基因座上发现LOH[23-25]，近年来在D5S818、D13S31基因座上相继发现因为沉默基因[26-27]，LOH导致单个基因座不符合遗传规律的报道。这种因为沉默基因所致LOH，使得杂合子的基因型在分型中变成纯合子参与亲权指数的计算，势必对鉴定意见产生影响，因此鉴定人日常工作检案中发现基因座不符合遗传规律时，需警惕样本中基因型为纯合子，且峰高明显低于同批样本同基因座峰高，或出现纯合子多步突变的情况时也需谨慎分析，避免将LOH误判为突变。

另外，在实际检案中很难在取材时就已明确检材是否来源于早期实体肿瘤患者，或者其他早期恶性血液病患者，Filoglu G等[28]人在针对急、慢性白血病患者的STR分型研究中，经血液和口腔分别取材，在100名患者中发现了2名患者存在LOH和基因不稳定的现象。另一项在胃癌、结直肠癌、乳腺癌患者的STR分型研究中[29]，采用冰冻保存和甲醛固定石蜡包埋的组织得到相同的STR分型结果，同样发现了LOH的现象。这些研究揭示了LOH直接原因并不是STR发生了传统意义的重复序列的增加或减少的突变，经过测序技证实为单核苷酸点突变导致。

因此，在接受复杂检案时，鉴定人无法判断检材是否来源于健康个体，或者检材是否经过复杂处理，这些因素都有可能导致STR分型出现偏差，这提醒司法鉴定人在处理复杂检材的时候需要综合SNP、Indel及测序技术等新技术判断，否则在亲权鉴定中将LOH误判为STR发生遗传突变，这极有可能对案件的结论造成不能避免的错误判断。

6 展望

STR基因座突变是普遍存在的现象，影响STR突变的因素多样且复杂，为了确保检案鉴定结果的准确性，在亲子及亲缘关系鉴定中，必须全面考虑所有符合与不符合孟德尔遗传规律的等位基因，正确分析突变，计算CPI，最终给出“支持”或者“排除”的鉴定意见，若达不到认定标准，则需要额外增加常染色体STR基金座进行检测，甚至将Y-STR或X-STR作为补充；同时也需综合考虑检材身源者的民族、性别、年龄和基因座的LOH及突变频率等，尤其是特殊疾病患者或经过特殊处理的检材，更需谨慎分析STR分型结果。复杂检案中，还可以联合应用SNP、Indel等遗传标记系统或二代测序技术等检测手段，排除复杂因素的干扰，以确保鉴定结果的准确性，降低误判风险。

随着STR突变数据的不断积累，研究STR的突变也是对DNA数据库的重要补充，有利于完善法医物证学领域的理论体系，对复杂、疑难检案的准确判定具有重要指导意义。