环状RNA对心血管疾病的影响

刘人可 曾研 彭道泉

环状RNAs(circular RNAs，circRNAs)是竞争性内源性RNAs领域，甚至整个RNA领域中的研究重点，其特征是5’端和3’端连接形成环状独特结构。天然circRNAs已被证实是一种丰富、稳定、多样和保守的RNA分子，在RNA的相互作用网中起着不可或缺的作用。通过测序技术，在真核细胞中发现了丰富的circRNAs。大量研究表明其是一种具有较多的功能的内源RNA，具有微小RNA的海绵功能，可在剪接中参与线性RNA竞争；也能在调节转录的环节起到作用[1]。此外，circRNAs被证实涉及许多疾病的发生和发展过程，其在心血管疾病的作用已成为研究热点[2]。

1 CircRNAs的发现和分布

CircRNAs是一组“古老”而又“新鲜”的非编码RNA分子(non-coding RNA，ncRNA)，于1976年在植物病毒中被发现。近年来，高通量测序技术的突破，发现认为circRNAs广泛存在于真核细胞中，包括苍蝇、哺乳动物和人类。2013年，Hansen等[3]发现circRNAs的重要作用。越来越多的研究表明，circRNAs参与疾病起始和进展，可作为新的临床诊断和预后标志物。

2 CricRNAs的合成

2.1 剪接体依赖性环化途径。

大多数真核生物circRNAs在选择性剪接过程中产生，由机械剪切力或Ⅰ/Ⅱ组核酶催化。反向剪接反应的加工需要规范剪接体，circRNAs是一种能够调节剪接和催化环化形成的顺式调节元件[3-4]。虽然具体的机制未知，相对合理的解释认为随着剪接小核核糖(splicing nuclear RNA，snRNPs)在前体信使RNA上的连续组装，外显子的下游5’供体部位与上游3’受体位点相结合催化circRNAs合成。与经典的剪接相比，反向剪接的效率非常低，可能是因为反向剪接不利于剪接体的组装。

2.2 内含子配对驱动环化和套索驱动环化途径。

在“内含子配对驱动环化”过程中，大量的circRNAs依赖于内含子反向互补的模体，互补的片段两端分别是GU富集片段和C富集片段，两者首尾相连，形成的circRNAs能避免被RNA酶水解。而原始转录中的供体与受体配对可使5’端至3’端紧紧相连，促进外显子的环化。套索驱动环化由量个外显子组成的剪接供体共价结合，切除中间所有内含子形成的circRNAs。经典的跳读外显子跳跃导致锁状结构的产生，是这个模型的关键并可以促进外显子的环化。

3 CircRNAs的功能

3.1 微小RNA的“海绵”功能

CircRNAs是一种新型的竞争性内源性RNAs，作为微小RNA的“海绵”，它能与其结合并通过碱基互补配对反向调节相关微小RNA。已知微小RNA与靶向信使RNA的非翻译区(3’UTR)的互补位点结合，抑制蛋白翻译，或促进信使RNA转录后的降解[5]。CircRNAs可调节微小RNA靶基因的活性，在调控转录后水平上发挥间接的作用，影响微小RNA的生物学功能。CiRS7(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)是最近确定的人类circRNAs，其拥有超过70个常规的微小RNA7结合位点，因此被称为miR7的超级“海绵”[1，6]。CiRS7与小鼠脑中的微小RNA7共表达，特别是在大脑皮质和海马神经元中。通过促进核酸外切裂解实现，其可有效抑制微小RNA7活性、导致微小RNA7靶向转录水平的增加，抑制微小RNA与其介导靶点之间的稳定性[7]。

3.2 转录后调节

大多数由内含子形成的circRNAs位于细胞核中，几乎无微小RNA结合功能。但有研究发现，敲除circRNAs后可阻止相应基因的转录[8]。CircRNA circ-ankrd52位于与其相关基因的转录起始区，并可促进RNA聚合酶Ⅱ的功能。初步证明，circRNAs的功能是促进相应基因的转录。因为某些circRNAs具有RNA聚合酶Ⅱ结合位点，它可通过结合RNA聚合酶Ⅱ，调节选择性剪接和转录过程[8]。EIciRNA(exonic-intronic circRNA)由外显子和内含子合成，也主要定位在细胞核中，对转录进行调控。U1snRNP(small nuclear ribonucleic proteins)是U1小核RNA剪切时用到的一种小核RNA，可相互作用，通过相互结合增强亲本基因的表达[6]。CircRNAs可与RNA结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)形成复合物，抑制转录或通过WatsonCrick碱基配对原则，直接调控信使RNA的表达[7]。许多其他含有翻译起始位点的circRNAs也具有类似的功能。因此，对基因转录过程的调节是circRNAs一个重要的功能。

3.3 翻译水平的调节

研究证明，在真核细胞中若环状mRNA含有可直接与核糖体结合的“内部核糖体进入位点”(internal ribosome entry site，IRES)序列，被翻译。而真核生物核糖体40S亚基无论在体外或体内，一旦在入口点与circRNAs结合后就能够启动翻译。此外，Naoko等[9]发现，在大肠杆菌无细胞翻译系统中，含有无限开放阅读框(open reading frame，ORF)的circRNAs也可被翻译产生蛋白质。其他研究表明，将含有绿色荧光蛋白的开放阅读框连接入circRNAs中，可在大肠杆菌中成功转录绿色荧光蛋白[10]。一些circRNAs可在活的人类细胞中翻译，不受常规翻译启动中必不可少的第三部分的影响，比如内部核糖体进入部位、polyA尾或帽结构等。此外，circRNAs可通过类似于聚合酶反应的滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)的方式在真核转译系统中进行蛋白质合成。无需与RNA模版多次结合，circRNAs不仅可产生长重复序列，还可在一定时间段内达到比其线性RNA更高的生产力[9]。EIciRNAs可对mRNA进行狙击，通过隔离转录起始点的方法减少线性RNA的翻译。EIciRNA形成时可发生可变剪接，线性RNA缺少翻译起始点而无法进行翻译[11]。因此，存在于人类细胞中的外显子circRNAs的翻译比先前想象的更有可能。但仅外源性circRNAs才能在真核细胞中编码蛋白质，迄今无直接证据能证明天然真核内源性circRNAs可被翻译。

3.4 环化过程影响选择性剪接

通常，circRNAs被认为是蛋白质编码基因剪接过程的特殊功能性副产物。大部分circRNAs都是外显子。因此circRNAs的形成过程可能会影响相关preRNA-RNA前体的选择性剪接，导致基因表达的改变。RNA结合模体蛋白20(RNA binding motif protein，RBM20)，对于源自Titin基因I带的circRNAs亚型的合成至关重要。在RBM20敲除小鼠中，最初源自circRNAs合成的外显子在线性RNA中更加浓缩[12]。因此，被环化的外显子越多则其对应的信使RNA的外显子越少。虽然还未发现内源性的circRNAs可被翻译成蛋白质，但可推测某些基因剪接相关蛋白的过表达或缺失也可通过影响circRNAs来调节信使RNA的合成，进一步调节基因表达。

4 CircRNAs与心血管疾病

最近的几项研究显示，circRNAs可能在心血管疾病的发生和发展中起重要作用。

4.1 心脏相关RNA(heart-related RNA，HRCR)对心脏病理性肥大和心力衰竭的作用。

内源性调子因子微小RNA223可诱导心脏肥大和心衰。凋亡抑制因子ARC在心肌细胞肥大和凋亡中起保护作用，微小RNA223通过调节下游靶点ARC发挥病理作用[13]。CircRNAs可作为微小RNA的“海绵”与微小RNA结合并影响其表达。Wang等[14]证实，心源性circRNA HRCR可以通过直接结合微小RNA223，抑制微小RNA223的活性，诱导ARC表达的增加，抑制心肌细胞和心脏肥大和心力衰竭。CircRNAs可能为临床上有价值的心力衰竭生物标志物，但需广泛的验证和研究[13]。

4.2 CircRNA Cdr1as可诱导心肌梗死的发生和发展。

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常危及生命。在MI发展过程中，长时间的心肌缺血缺氧促进心肌细胞的凋亡。ZNF292作为锌指结构域的转录因子在内皮细胞高度表达，cZNF292为内皮细胞中由缺氧诱导并表达的circRNAs。在缺氧内皮细胞中，cZNF292水平升高有助于内皮细胞的形成，而circRNAs参与调控低氧心肌内皮细胞功能[15]。转录因子SP1和聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)能促进细胞凋亡，是微小RNA7的下游靶向基因[16]，微小RNA7通过负向调节PARP的表达，抑制缺氧情况下的细胞凋亡，发挥心肌保护作用。Zhao等[7]发现，Cdr1as作为circRNAs的一种，可起到微小RNA7“海绵”作用，抑制微小RNA7的活性。Cdr1as通过与微小RNA7a直接结合，降低微小RNA7a的活性，上调miR-7靶向基因(如PARP和SP1)的表达，加重心肌细胞损伤。

4.3 CircRNA cANRIL与动脉粥样硬化风险密切相关

全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)发现，INK4/ARF基因位点附近的9p21染色体的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与粥样硬化性血管疾病有关，表明9p21.3染色体与粥样硬化性血管疾病的易感性相关。Liu等[14]证实，粥样硬化性血管疾病相关的9p21染色体SNP可以调控INK4/ARF的表达(INK4a：细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂；ARF：可变阅读框)。CircRNA ANRIL(cANRIL)是来自INK4/ARF基因位点的反义转录物，INK4/ARF位点附近的9p21.3染色体上的SNP可通过调控ANRIL的剪接和cANRIL合成，调控INK4/ARF的转录。因此，INK4/ARF转录过程中的选择性剪接可影响cANRIL的结构和表达。由于cANRIL可通过PcG复合物招募影响PcG介导的INK4/ARF沉默，Burd等[17]推测，cANRIL的结构修饰可使PcG介导的INK4/ARF沉默和动脉粥样硬化易感性改变。因此，cANRIL与动脉粥样硬化风险程度有关。研究发现，氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞中hsa_circ_0003575表达上调，并在功能验证实验揭示了hsa_circ_0003575沉默，在氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞中有促进血管内皮细胞增殖和血管生成的作用[18]。这些发现都将为动脉粥样硬化血管内皮细胞损伤提供新的治疗策略。

4.4 CircRNA Circ-Foxo3诱导心脏细胞的衰老表型

Circ-Foxo3衍生自转录因子Foxo3，是叉形头转录因子家属成员(Foxo)的circRNAs，其在老年小鼠和患者的细胞质中高度表达[19]。研究证明，细胞中circ-Foxo3的高表达使细胞周期停滞在G1期，且不能进入到S期。Du等[19]发现circ-Foxo3的表达可抑制细胞增殖和细胞周期进程，且异位表达的circ-Foxo3与衰老相关蛋白ID1和E2F1以及应激相关蛋白低氧诱导因子1α(hypoxia-induced factor 1a，HIF1α)和黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)结合。由于HIF1α(应激蛋白)和FAK(应激蛋白)对衰老产生负面影响，细胞质中circ-Foxo3的数量增加导致通过阻断细胞质中ID1、E2F1、HIF1α和FAK，抑制此类蛋白质在细胞核中的水平，促进细胞的衰老表型，为抑制心脏衰老和心肌保护方面提供了潜在的新治疗方法。

4.5 新发现

AKT是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，影响细胞增殖转录和凋亡。PDK1(phosphoinositide dependent kinase 1)为3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1。两者通常分布在细胞质中，异位表达的circ-Amotl 1通过与AKT1和PDK1形成三元化合物，促进AKT与PDK1的结合，诱导AKT磷酸化和pAKT核易位，增强细胞存活，抑制凋亡。CircRNA- circ-Amotl 1优先表达在新生儿心脏组织中，异位表达circ-Amotl 1可提高细胞存活率，减少细胞凋亡。与对照组相比，多柔比星处理后小鼠心脏功能明显降低，通过腹腔注射circ-Amotl 1促进其表达，可治疗甚至消除多柔比星的心脏毒性。在细胞核中，pAKT通过直接磷酸化正向调节增殖相关的因子、并负向调控促凋亡蛋白的表达[20]。外源性circ-Amotl1的表达可减少心肌细胞纤维重建，增加心肌细胞的抗凋亡能力，削弱多柔比星诱导的心肌纤维重建，对心功能起到保护作用。总之，这些都为心肌损伤修复提供新的干预靶点和治疗策略[21]。

5 展望

目前我们对circRNAs的了解和探索尚未成熟，与心血管疾病相关的circRNAs更是少之又少。相信我们会发现更多与心血管疾病相关的circRNAs及其作用机制，为心血管疾病诊断及治疗提供新的思路和治疗靶点。

利益冲突：无