白僵菌和绿僵菌不同菌株对马尾松毛虫的致病力

蔡守平，何学友，曾丽琼，苏文晶，陈文玉，陈世勇

(1.福建省林业科学研究院、福建省森林培育与林产品加工利用重点实验室，福建 福州 350012； 2.泉州市森林病虫防治检疫站，福建 泉州 362000；3.泉州森林公园管理处，福建 泉州 362000； 4.泉州台商投资区科技经济发展局，福建 泉州 362100)

马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)是我国南方松林中的历史性害虫，仅福建省每年发生面积达数万公顷，造成了重大损失[1]。自20世纪50年代在福建、广东等省开始应用球孢白僵菌(Beauveriabassiana)防治马尾松毛虫，70年代在南方各省广泛应用，数十年来白僵菌成为了马尾松毛虫防治的主要手段，在松林的防灾减灾中发挥了重要的作用[2-3]。前人筛选出对松毛虫具有高致病力的优良白僵菌菌株，为马尾松毛虫的高效防治提供了基础[4-7]，也有学者尝试将金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)应用于防治马尾松毛虫，并取得了一定的成效[8-9]。然而，不同的白僵菌和绿僵菌菌株对靶标害虫的致病力存在着显著的差异[4，10-11]，同时菌株在长期的传代培养中也会出现菌株退化、致病力下降等问题[12-14]。因此，不断筛选高致病力和定向培育优良菌株是白僵菌和绿僵菌应用中重要内容之一，也是保持和提高白僵菌和绿僵菌对靶标害虫防治效果的重要手段[14]。本文比较了不同来源的白僵菌和绿僵菌菌株对4～5龄马尾松毛虫幼虫的致病力，旨在对马尾松毛虫的生产性防治提供新的菌株资源。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

供试的马尾松毛虫4～5龄幼虫于2015年4月上旬采集于福建省泉州台商投资区张坂镇，试虫采回后放入养虫笼中以新鲜马尾松针叶饲养1 d后，选取健康的幼虫用于生物测定。

1.2 供试菌株

供试菌株为4株金龟子绿僵菌和7株球孢白僵菌，除MaV275、Ma4556绿僵菌菌株由英国同行赠送外，其他菌株均由福建省林科院森保所研究人员从福建福州、安溪等地林间采集、分离、保存。所有菌株均保存于福建省林科院。供试菌株信息见表1。

1.3 不同菌株菌落生长速度及产孢量的测定

不同菌株的生长速度测定参考蔡守平等[11]的方法，以中心接种的方式将不同菌株接种于PPDA平板培养基中心，然后置于(25±1) ℃的恒温培养箱中培养，用十字交叉法每5 d测量1次菌株直径(以纵横直径的平均值作为菌落直径)，15 d后待菌落产孢充分后以打孔器在菌落上取一定面积的菌落，使用0.03%的吐温-80溶液进行稀释，最后用血球计数板计数并换算成单位面积的产孢量。每个菌株设置3个重复，产孢量测定每个菌落取3个菌落块，共重复9次。

表1 供试菌株及来源

1.4 不同菌株对马尾松毛虫幼虫的致病力比较

从各菌株的菌落表面刮取分生孢子置于无菌水中，加入少量吐温-80溶液充分振荡，通过梯度稀释的方法，配制成5×107孢子·mL-1的孢子悬浮液，用于接种准备好的马尾松毛虫幼虫。接种时，将养虫笼中的马尾松毛虫用镊子小心取出，在孢悬液中浸渍5 s，然后单头放置于表面消毒过的养虫盒中，并以新鲜马尾松针叶饲养，将接种后24 h内死亡的幼虫剔除，每菌株最终接种数量见表3(因孢子悬浮液配制偏少，球孢白僵菌BbAX-02菌株接种20头)，接种后在22～27 ℃的室温条件下饲养，隔天换针叶，统计死亡情况，虫死后进行保湿培养观察各菌株感染情况。用无菌水接种作为对照。生物测定试验于2015年4月在福建省林科院森保所实验室完成。

1.5 数据分析

菌株菌落生长和产孢量数据使用SPSS软件分析，多重比较使用Ducan′s法，生物测定数据应用DPS数据处理系统进行统计分析，时间—死亡率机率值分析法建立致病力回归方程，估算致死中时(LT50)[15]。

2 结果与分析

2.1 不同菌株的菌落生长与产孢情况比较

不同绿僵菌、白僵菌菌株的菌落生长与产孢情况见表2。各菌株的菌落直径间存在显著差异，菌落直径较大的是球孢白僵菌BbPT-01、BbTA-01菌株和绿僵菌MaFZ-04、MaV275菌株，培养15 d后菌落直径均超过6 cm；而菌落直径较小的为球孢白僵菌BbHA-10、BbHA-01菌株，培养15 d后菌落直径分别为3.70、2.94 cm。各菌株的产孢量间也存在显著差异，其中以球孢白僵菌BbAX-04菌株、金龟子绿僵菌MaMXTR-01、Ma4556菌株产孢量较大，超过1.2×108孢子·cm-2；产孢量最小的是绿僵菌MaV275菌株和白僵菌BbFZ-11菌株。分析发现，各菌株的菌落直径和产孢量之间的相关性并不明显。

表2 不同菌株的菌落直径及产孢量

2.2 不同白僵菌、绿僵菌菌株对马尾松毛虫幼虫的致病力比较

图1 马尾松毛虫幼虫接种不同白僵菌、绿僵菌累积死亡率变化

不同菌株的孢子悬浮液接种4～5龄马尾松毛虫幼虫后，其累积死亡率变化见图1。从图1可知，马尾松毛虫幼虫接种不同菌株后的累积死亡率差异较大。接种白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的累积死亡率较高，死亡速度也快，接种12 d后，马尾松幼虫累积死亡率分别达到100%、90%，远比其他菌株高。接种20 d后，除白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株外，其他菌株的累积死亡率最高为66.7%(白僵菌BbTA-01)，最低仅为15%(绿僵菌MaMXTR-01)。

通过时间—死亡率机率值分析法建立各菌株对马尾松毛虫幼虫的致病力回归方程，结果见表3。各回归方程的相关系数均大于0.9，P值均大于0.05，表明所建立的回归方程是可信的。根据回归方程估算出各菌株对马尾松毛虫幼虫的致死中时(LT50)，白僵菌中BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50最短，分别为7.25、7.42 d；其次是BbTA-01菌株，为13.02 d。绿僵菌中LT50最短的是Ma4556菌株，LT50为13.67 d；其他菌株LT50均大于15 d，致病力较差。从感染率上来看，也是BbAX-02、BbAX-04菌株最高，分别为95%、90%，比其他菌株高。

表3 不同菌株对马尾松毛虫幼虫的致病力

3 讨论

不同来源白僵菌、绿僵菌的菌株对靶标害虫的致病力存在显著差异，也就是说存在一定的寄主专化性。因此，在应用白僵菌、绿僵菌进行生物防治时，筛选出对靶标害虫致病力强的菌株是重要的基础工作。本研究中，分离自马尾松毛虫幼虫的白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株对4～5龄马尾松毛虫的致死率高，致死速度快，LT50分别为7.25、7.42 d，比其他菌株时间短，可见这2个菌株对马尾松毛虫的致病力最强，可作为优良的生产菌株生产出产品，用于马尾松毛虫的林间防治。

虫龄是影响白僵菌、绿僵菌对靶标害虫致病力的重要因素，一般虫龄越小致病力越强[16-17]。马尾松毛虫一般6龄结茧化蛹[18]，因采集时间原因，本研究中使用的试虫为4～5龄马尾松毛虫幼虫已属于大龄幼虫，从致病力测定结果来看，仅白僵菌BbAX-02、BbAX-04菌株的LT50在7 d左右；其余的菌株均超过10 d，而其中7个菌株甚至超过了15 d，说明致病力较差。其原因可能是由于菌株本身致病力的差异，也有可能是试虫的虫龄较大造成的[16-17]。因为虫龄大，其自身的抗性较强[16-17]。王义勋等[7]筛选出的高致病力白僵菌菌株对3龄马尾松毛虫幼虫LT50分别为7.63、7.62、7.88 d，与本研究中筛选出的高致病力菌株的LT50相近，可见本研究中筛选出的优良菌株对马尾松毛虫幼虫致病力较高。

虽然本试验筛选出了致病力较高的优良菌株，但其快速致死效应并不显著，这也是生物制剂应用经常被诟病的问题[19-20]。因此，在筛选高致病力菌株的基础上，进一步研究白僵菌制剂与高效低毒农药的复配剂，提高杀虫速度同时增加白僵菌的侵染率，达到增效的目的，是一个重要的研究方向，不同学者在这方面已经开展了一些有意义的工作[19-20]。