固态发酵仔猪配合饲料的动力学研究

■管军军 张天勇 董 玲 王志祥

（1.河南农业大学畜牧学博士后科研流动站，河南郑州450002；2.河南广安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南郑州450001；3.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳110036）

近年来，一些研究工作者提出利用生物发酵的方法来解决仔猪配合饲料设计与生产中存在的一些问题：纤维素或木质素含量过高，含有抗原性蛋白，添加剂未合理使用等问题[1-2]。筛选一种或几种益生菌降解饲料中纤维素、抗原蛋白为低聚糖、小肽等营养物质，同时微生物代谢产生各种酶、活性物质有利于仔猪的消化吸收[3-4]。

目前，发酵饲料研究与生产主要以固态发酵为主，从生物反应过程中的本质考虑，固态发酵最显著的特征就是水分活度低，菌体生长、物质吸收、产物分泌等具有不均匀性，导致体系中物质传递具有不连续性，使得发酵过程的各种参数的精确控制比较困难[5]。为解决上述过程控制问题，科研工作者常常从固态发酵动力学上进行研究[6]。当然，不同的固态发酵体系，其动力学的数学模型不同，因此，迄今为止,仍未见到较为完善的有关适用大部分固态发酵过程的数学模型的报道[5]。

对此，本课题组结合固态发酵仔猪配合饲料的产业化实际情况，在前期系统研究前处理工序、单菌种发酵工艺及菌种组合的基础上，本研究主要集中单菌种(枯草芽孢杆菌、酵母和乳酸菌)及其混菌组合（双菌种和三菌种）的固态发酵动力学的研究，为固态发酵仔猪配合饲料的过程控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

枯草芽孢杆菌BS-GA15购自润盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌为河南工业微生物菌种保藏中心提供；上述各菌种经过筛选驯化后，并加以辅料经冷冻干燥制成发酵剂（＞108CFU/g），冰箱5℃保存备用。仔猪配合饲料551H及552H由河南广安生物科技股份有限公司生产，其组成如表1所示；另外，葡萄糖等试剂均为分析纯，购自郑州新丰化验器材有限公司。

1.2 主要仪器设备

SPX-250B智能型生化培养箱，上海琅玕实验设备有限公司；JJ-CJ-1FD超净工作台，吴江市净化设备总厂；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；FA2004B电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 粗蛋白的测定

利用凯氏定氮法GB/T6432—1994对仔猪配合饲料或发酵产品进行粗蛋白的测定。

1.4 发酵试验

将菌种发酵剂接种到培养液[2%（w/v）仔猪配合饲料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸馏水]中，振荡均匀，置于30℃条件下振荡培养，转速为150 r/min，培养4 h。取发酵剂活化液一种（单菌种发酵）或几种（混菌发酵）接种到固态发酵培养基[仔猪配合饲料551H或552H与蒸馏水(6∶4)组成，装料100 g/瓶]上，总接种量为5%，混菌发酵各菌种比例利用前期研究的结果[7]选择最佳配比，具体见表2所示。搅拌均匀后，置于培养箱中30℃固态发酵，一定时间后取样，50℃条件下干燥成品备用。所有试验处理均重复3次。

表1 仔猪配合饲料551H及552H配方

表2 混菌发酵最佳菌种配比

1.5 动力学计算

通常，描述生物质变化与时间相互作用的方程有Logistic（逻辑）、指数及线性方程[8]，数学表达为：

式中：X——生物质的浓度，本研究中指蛋白浓度(%)；

X0——0时间点X值(%)；

K——生长率(%/h)；

μ——生长率常数(h-1)；

Xm——承载力(%)。

使用软件Polymath（6.0版）线性和非线性回归模块拟合方程（1）～（3），相关系数R2判断方程与数据相关性，均方根偏差（Rmsd）评估拟合度。

1.6 统计方法

利用SAS 9.0软件对试验结果进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 单菌种发酵

图1 单菌种固态发酵仔猪配合饲料蛋白的变化

单菌种固态发酵仔猪发酵配合饲料过程中，饲料蛋白含量的变化随着菌种不同而有所不同，而且不同的固态培养基，其结果也不相同(见图1)，但是发酵时间对于蛋白质含量的影响是非常显著的(551H：P=0.000 3＜0.01；552H：P＜0.000 1)。具体来说，对于551H(见图1A)，随着发酵时间的延长，蛋白含量开始上升，24 h后，酵母与乳酸菌发酵所得产品中蛋白质含量开始下降，而枯草芽孢杆菌则在32 h后则出现下降，40 h后，三种菌发酵的产品蛋白含量均出现小幅上涨；对于552H(见图1B)，在所研究的发酵时间内，酵母与乳酸菌发酵产品的蛋白含量基本处于上升态势，而枯草芽孢杆菌呈先升(＜32 h)后降(＞32 h)的态势。

为了进一步研究各菌种的发酵过程中饲料中蛋白变化态势，需要从动力学方程进行拟合分析。单菌种固态发酵动力学方程的拟合参数如表3所示。对于枯草芽孢杆菌固态发酵551H或552H，三种动力学方程的拟合结果中R2及Rmsd比较接近，因此这三种动力学方程均可描述该菌种的固态发酵过程，实际应用中线性方程应比较方便；但是，固态发酵552H过程所得拟合方程的R2＜0.8较551H低，因此，模型与实际数据的相关性较551H低，那么所拟合的动力学方程能更好地反应枯草芽孢杆菌对于551H的固态发酵过程。对于酵母或乳酸菌，在固态发酵551H过程中，Logistic方程的R2较大且Rmsd较小，故该动力学方程适合描述这两种菌种的发酵过程；而552H的固态发酵过程中，针对酵母或乳酸菌所拟合的各动力学方程中R2及Rmsd较为接近，因此，Logistic方程适合描述酵母和乳酸菌对于551H的固态发酵过程，而三种方程均可描述酵母和乳酸菌对于552H固态发酵过程。

表3 单菌种固态发酵仔猪配合饲料动力学方程拟合参数

2.2 双菌种混菌发酵

对于所研究的双菌种混菌固态发酵仔猪配合饲料，时间在该发酵过程中，对于产品蛋白的变化仍然影响非常显著（P＜0.000 1），如图2所示。具体来说，对于551H的固态发酵过程，蛋白变化基本上处于先升后趋于平缓的态势（见图2A）；而于552H的固态发酵过程，12 h内，变化平缓，超过12 h，蛋白变化趋于缓慢上升中(见图2B)。

图2 双菌种固态发酵仔猪配合饲料蛋白的变化

对于试验结果进行拟合所得动力学数据如表4所示。对于551H，各组合的拟合结果中，Logistic方程R2均在0.9以上，较其它两种动力学方程大，且Rmsd较小；对于552H，B+L(1∶1)与S+L(1∶1)拟合结果中各方程的R2均在0.9以上且Rmsd较小，而B+S(1∶2)仅Logistic方程的R2在0.9以上；因此，Logistic方程较为适合描述双菌种固态发酵551H及B+S(1∶2)固态发酵552H过程，而三种动力学方程均适合描述B+L(1∶1)及S+L(1∶1)固态发酵552H过程。

表4 双菌种固态发酵仔猪配合饲料动力学方程拟合参数

2.3 三菌种发酵

三菌种固态发酵仔猪配合饲料过程中蛋白的变化如同图3所示，时间仍然是其非常显著的影响因素（P=0.000 1＜0.01），而且蛋白的变化基本呈上升态势。经过对试验结果进行动力学方程拟合可知(表5)，对于551H，三菌种发酵过程所拟合的Logistic与线性方程R2在0.9以上且Rmsd较小；而对于552H，拟合方程R2均在0.9以上且Rmsd较小；因此，Logistic与线性方程可较好地描述三菌种固态发酵551H过程，而三种动力学方程均可较好地描述三菌种固态发酵552H过程。

2.4 讨论

动力学方程是生化反应过程中生物质的形成与时间关系的数学描述，从而可通过反应时间控制目标产物生成与变化，一定条件下，有效解决了生化反应复杂性对于产物的影响及在线监控指标等相关应用问题[6]。本研究中，由于饲料中蛋白作为一个主要组成部分，且参与发酵过程，因此，其变化能较好地反应固态发酵过程，所以，用蛋白的变化作为本研究的目标生物质的变化是合理的。通常，描述生物质变化的方程有三种：Logistic、指数及线性方程。按其复杂程度来说，Logistic方程最为复杂，但是能描述生物质的复杂变化，指数方程次之，而线性方程最为简单，并且应用方便。不论是哪一种方程，只要在一定条件下所拟合的参数与目标产物的变化存在相当高的相关性，拟合度较高，那么，该拟合方程对目标产物的变化与控制就有指导意义。

图3 三菌种固态发酵仔猪配合饲料蛋白的变化

统计学上，对于拟合方程的评价一般用R2及Rmsd来描述：R2较大且Rmsd较小，则所得方程与数据有很高的相关性与拟合度。R2＞0.7(R＞0.8)，具有较好的相关性；R2＞0.81(R＞0.9)，相关性很高；R2＞0.9(R＞0.95)，相关性非常高；至于R2＜0.7，一般认为相关性不高，不可接受。Rmsd越小，拟合度越高，通常R2较大则Rmsd较小。本次研究中，只有酵母与乳酸菌对于551H的固态发酵过程所拟合的指数与线性方程，R2＜0.7（表3），因此，这两种微生物固态发酵551H过程不能用指数与线性方程描述。而其它所研究的固态发酵过程所得到的拟合方程R2＞0.7，这三种动力学方程均适用。

表5 三菌种固态发酵仔猪配合饲料动力学方程拟合参数

另一方面，即使在R2＞0.7的情况下，或者对于本研究的所有固态发酵过程（图1～图3），发现同一过程的三种动力学方程的拟合结果中，拟合的Logistic方程具有最高的R2及最小的Rmsd（表3～表5），说明Logistic方程虽然复杂，但是非常适合描述固态发酵仔猪配合饲料过程。这也反应出固态发酵仔猪配合饲料是一个相当复杂的过程，若想精确控制该发酵过程，Logistic方程是一个较为合适的方法。

本研究结果是对0～48 h内所得数据的拟合方程，因此，该结果对于相关条件下48 h内固态发酵仔猪配合饲料有较好的指导作用。另外，在控制精度不高的情况下，除酵母与乳酸菌固态发酵551H外，线性方程是一个较好的选择，能较好地描述大多数固态发酵仔猪配合饲料过程。

3 结论

单菌种(枯草芽孢杆菌、酵母和乳酸菌)及其混菌组合（双菌种和三菌种）的固态发酵仔猪配合饲料的动力学研究表明：

①发酵时间对于固态发酵仔猪配合饲料的影响非常显著（P＜0.01）；

②单菌种固态发酵过程动力学：酵母和乳酸菌固态发酵551H过程只能用Logistic方程描述（R2＞0.9），其它发酵过程均可用Logistic方程、指数及线性方程描述（R2＞0.7）；

③混菌固态发酵过程均可用Logistic方程、指数及线性方程描述[双菌种（R2＞0.7）和三菌种（R2＞0.9）]；

④Logistic方程可以较为精确地描述固态发酵仔猪配合饲料过程[单菌种(R2＞0.7)，混菌(R2＞0.9)]，而线性方程能较好地描述大多数固态发酵仔猪配合饲料过程(R2＞0.7)。

本研究结果将为固态发酵仔猪配合饲料的过程参数与在线控制提供一定的理论支撑与指导。